朱召芹，景懷琦，陳海麗，胡蕓文，闞飆

1. 上海市(復(fù)旦大學(xué)附屬)公共衛(wèi)生臨床中心，上海201508; 2. 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206

目前，霍亂在世界范圍內(nèi)仍是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)專家會議估計(jì)，全球每年約發(fā)生550萬例霍亂，其中以亞洲、非洲和拉丁美洲流行較為嚴(yán)重，引起亞洲約10萬例和非洲約2萬例患者死亡。盡管人類對引起霍亂流行的霍亂弧菌認(rèn)識已久，但對其致病性及毒力相關(guān)功能基因尚不完全清楚。

雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(twin-arginine translocation system，Tat系統(tǒng))是1997年Settles等[1]發(fā)現(xiàn)的存在于原核生物中的蛋白質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng)，負(fù)責(zé)運(yùn)輸完全折疊蛋白，并結(jié)合一定的氧化還原因子[2]，其特點(diǎn)是蛋白N端信號肽存在一保守的雙精氨酸結(jié)構(gòu)域(S/T-R-R-x-F-L-K)[3]。目前，Tat系統(tǒng)已陸續(xù)在大腸埃希菌、幽門螺桿菌、耶爾森鼠疫桿菌、傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌、霍亂弧菌、流感嗜血桿菌、葡萄球菌等細(xì)菌染色體中被發(fā)現(xiàn)[4-6]。Tat系統(tǒng)不但在細(xì)菌生理功能方面，而且在一些病原微生物的致病性中發(fā)揮作用，推測可能也是一種新的毒性決定因素[1]。大多數(shù)細(xì)菌Tat系統(tǒng)在葉綠體膜和細(xì)胞膜中發(fā)揮作用[7,8]。已進(jìn)行深入研究的細(xì)菌以革蘭陰性大腸埃希菌和革蘭陽性枯草桿菌為典型代表。大腸埃希菌的Tat系統(tǒng)需3種不同功能的膜結(jié)合蛋白成分(TatA、TatB和TatC)。目前革蘭陰性菌比較普遍的Tat系統(tǒng)模型是TatB和TatC構(gòu)成復(fù)合體，識別并結(jié)合到雙精氨酸信號肽。TatA形成寡聚體，在TatB和TatC協(xié)同作用下，很可能在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起通道作用。

氧化三甲胺(trimethylamine-N-oxide，TMAO)是存在于胞質(zhì)并參與細(xì)菌呼吸能量代謝的重要物質(zhì)，也是Tat系統(tǒng)的底物，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌Tat系統(tǒng)的功能研究。在厭氧培養(yǎng)條件下，TMAO是細(xì)菌的唯一電子受體，如細(xì)菌能在TMAO培養(yǎng)基上生長[9]，即說明TMAO可被Tat系統(tǒng)進(jìn)行功能性轉(zhuǎn)運(yùn)，從而推測Tat系統(tǒng)具有功能[9,10]。

雖然我們的前期研究提示霍亂弧菌有功能性的Tat系統(tǒng)，且與霍亂弧菌生物膜的形成和毒力有一定的相關(guān)性，但目前對霍亂弧菌Tat系統(tǒng)基因簇的各基因功能尚不清楚，尤其是霍亂弧菌Tat系統(tǒng)基因簇橫跨Ⅰ、Ⅱ號2個染色體，通過序列比對沒有發(fā)現(xiàn)TatD基因存在。為深入研究霍亂弧菌Tat系統(tǒng)相關(guān)基因及功能，本研究通過構(gòu)建系列缺失株、回補(bǔ)株，進(jìn)一步分析其基因功能、基因簇各構(gòu)成基因功能，并確定功能必需基因。

1 材料和方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

本研究所用菌株、質(zhì)粒及其特征詳見表1。

表1 研究所用的菌株和質(zhì)粒Tab.1 The strains and plasmids used in the study

Tat系統(tǒng)基因缺失株的構(gòu)建：將含有插入片段的pDS132[7]重組質(zhì)粒與N16961中擬敲除片段的上下游序列同源重組，使部分基因或全部基因片段敲除。以含有插入片段pDS132重組質(zhì)粒的SM10為供體菌，N16961野生株為受體菌，分別進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，獲得接合子。接合子帶有自殺質(zhì)粒pDS132的氯霉素抗性和sacB基因(編碼果聚糖蔗糖酶，對宿主菌在蔗糖濃度>5%的培養(yǎng)基上生長是致死性的)。首先用慶大霉素選擇性培養(yǎng)基(或TCBS培養(yǎng)基)加氯霉素抗性平板進(jìn)行陽性結(jié)合子篩選，然后用20%蔗糖培養(yǎng)基進(jìn)行2次同源重組篩選，以排除目的基因只進(jìn)行1次同源重組、自殺質(zhì)粒仍未完全脫落的接合子，最后對篩選的缺失株進(jìn)行鑒定。

1.2 試劑

TMAO、甲基紫精(methyl viologen，MV)、鉬酸銨(ammonium molybdate)、硫胺素(thiamine，維生素B1)和亞硒酸鉀(potassium selenite)購于Sigma公司，氯霉素購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 周質(zhì)和原生質(zhì)體的分離

Tat系統(tǒng)可將轉(zhuǎn)運(yùn)底物從胞質(zhì)至周質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因此測定細(xì)菌胞質(zhì)和周質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)底物的量可幫助判斷Tat系統(tǒng)的功能。將霍亂弧菌N16961野生株和各缺失株用LB培養(yǎng)過夜，次日1∶100轉(zhuǎn)種至新鮮培養(yǎng)基，待菌生長至OD600=0.8，離心收集細(xì)菌。按每1 g濕菌加入5 ml 0.2 mol/L pH 8.0 Tris緩沖液，將細(xì)菌沉淀物懸起，然后按每1 g濕菌加入5 ml 0.2 mol/L pH 8.0 Tris和34%蔗糖溶液。冰上加入0.5 mol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，使其終濃度達(dá)1 mmol/L并混勻。冰浴2.5 min。加入溶菌酶，使其終濃度為0.1 mg/ml，冰浴2.5 min。緩慢滴加預(yù)冷的三蒸水 10 ml，在5 min內(nèi)滴完。13 400g離心20 min，上清液吸出，即為周質(zhì)。沉淀物為原生質(zhì)體。沉淀物用50 mmol/L Tris + 5 mmol/L MgCl2(pH 7.6)洗1次，超聲破碎，13 400g離心，上清液為細(xì)胞質(zhì)[2]。

1.4 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鉬酶活性的檢測

基于對甲基紫可視化活性染色法，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native polyacrylamide gel electrophoresis，native-PAGE)檢測霍亂弧菌野生株和缺失株細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)內(nèi)TMAO還原酶的活性[4]。電泳結(jié)束前，將50 ml磷酸鹽緩沖液放入500 ml量筒中，用一次性手套將量筒封好并用皮筋勒緊。緩慢從液體底部向緩沖液充氮?dú)?5 min，加入MV溶液500 μl，繼續(xù)充氮?dú)?5 min。將非變性膠小心取下，浸泡在非變性電泳緩沖液中待用。將充完氮?dú)獾牧姿猁}緩沖液快速倒出25 ml于一次性平皿中，加入少量用0.01 mol/L NaOH溶解的NaS2O4，直至液體全部變藍(lán)。對凝膠進(jìn)行染色3～5 min至整個膠面呈深藍(lán)色，移至含有酶作用底物TMAO的染液內(nèi)繼續(xù)染色數(shù)分鐘。將膠移至兩膠片中以隔絕空氣，通過酶與底物作用，產(chǎn)生新生氧氣，從而使染料氧化變白，即在該酶泳動條帶處呈現(xiàn)白色條帶。用凝膠成像儀或照相機(jī)記錄結(jié)果[2]。

1.5 Tat底物TMAO(torA基因編碼)的檢測

用M9-TMAO基礎(chǔ)培養(yǎng)基來檢測Tat野生株和缺失株的Tat系統(tǒng)功能是否存在[13]。在厭氧培養(yǎng)條件下，TMAO是M9-TMAO基礎(chǔ)培養(yǎng)基中唯一能提供能量的營養(yǎng)成分，同時TMAO又是公認(rèn)的Tat系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)底物，所以細(xì)菌在厭氧培養(yǎng)條件下對TMAO的利用情況可直接反映Tat系統(tǒng)功能。將培養(yǎng)基分裝后，待檢測菌株置37 ℃厭氧靜止培養(yǎng)。測定不同培養(yǎng)時間的菌液濁度(OD600)，據(jù)此判斷細(xì)菌生長情況。

1.6 生物信息學(xué)分析

采用BLASTn程序在GenBank中搜尋與已知大腸埃希菌MG1655(K12)的Tat系統(tǒng)基因簇(tatA、tatB、tatC、tatD和tatE)DNA序列具有同源性的霍亂弧菌N16961基因，再進(jìn)一步用Bioedit軟件進(jìn)行相應(yīng)序列的比對。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用one-way ANOVA對各組進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 霍亂弧菌Tat系統(tǒng)基因簇的生物信息學(xué)分析

不同細(xì)菌中Tat系統(tǒng)基因的結(jié)構(gòu)和組成不同。本研究通過對已測序的霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)株N16961基因組與大腸埃希菌tatA、tatB、tatC、tatD操縱子同源性分析，預(yù)測霍亂弧菌N16961存在Tat系統(tǒng) 的主要基因(表2)。tatA(VC0086)、tatB(VC0087)和tatC(VC0088)位于Ⅰ號染色體上，與大腸埃希菌不同的是，在霍亂弧菌N16961Ⅰ號染色體上沒有發(fā)現(xiàn)與大腸埃希菌tatE同源性高的基因片段，與大腸埃希菌tatE基因同源性高的基因tatA2(VCA0533)位于霍亂弧菌小染色體上(Ⅱ號染色體)；tatA、tatB、tatC基因簇附近沒有tatD基因。盡管霍亂弧菌的tatA2基因與大腸埃希菌的tatA和tatE基因編碼蛋白的氨基酸序列均具有一定同源性(分別為36.7%和38.2%)，但由于大腸埃希菌tatA、tatB、tatC、tatD與tatE位于不同操縱子下游，因此根據(jù)霍亂弧菌tatA2位置初步推測其在Tat系統(tǒng)功能上可能相當(dāng)于大腸埃希菌的tatE?；魜y弧菌Tat系統(tǒng)各基因編碼蛋白與大腸埃希菌對應(yīng)基因編碼蛋白的氨基酸同源性為43.3%～65.7%。除Tat系統(tǒng)基因外，電子傳遞鏈和能量代謝相關(guān)基因、細(xì)胞色素c551過氧化物酶基因(VC0089)和輔酶Q蛋白合成Aarf基因(VC0085)分別位于tatA、tatB、tatC操縱子的下游和上游。

表2 N16961 Tat系統(tǒng)基因簇分析Tab.2 The analysis of gene cluster of Tat system in N16961*

2.2 霍亂弧菌Tat系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的研究

為確認(rèn)經(jīng)序列比較而推測的霍亂弧菌Tat系統(tǒng)是否具有蛋白運(yùn)輸功能，本研究比較霍亂弧菌的野生株與缺失株在厭氧培養(yǎng)條件下于TMAO基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長狀況，觀察細(xì)菌是否可利用TMAO作為唯一的能量來源。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖1、2)，當(dāng)霍亂弧菌N16961的Tat系統(tǒng)基因簇中tatA、tatB、tatC3個基因同時缺失或tatA、tatB、tatC和tatA24個基因同時缺失時，菌株不能在TMAO基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長，提示這些基因的完整性對霍亂弧菌Tat系統(tǒng)功能很重要。單獨(dú)缺失tatB或tatC基因時，細(xì)菌生長明顯受限，說明這2個基因?qū)at系統(tǒng)的功能很重要；而單獨(dú)缺失tatA或tatA2基因時，細(xì)菌生長僅一定程度受限，提示兩者存一時對Tat系統(tǒng)功能影響不大，但tatA和tatA2雙基因同時缺失，Tat系統(tǒng)功能則完全受阻。

圖1 厭氧培養(yǎng)條件下野生株和缺失株在M9-TMAO基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長狀況Fig.1 Wild type and mutant strains in M9-TMAO basal medium under anaerobic culture condition

2.3 霍亂弧菌Tat的轉(zhuǎn)運(yùn)底物

TMAO為Tat的轉(zhuǎn)運(yùn)底物，Tat可將TMAO從細(xì)菌胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)，因此檢測細(xì)菌胞質(zhì)和周質(zhì)TMAO活性成為細(xì)菌Tat功能驗(yàn)證研究中廣泛使用的方法[4,13,14]。研究發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌N16961無論胞質(zhì)還是周質(zhì)中TMAO活性檢測均為陽性，而Tat基因缺失株N169-dtatABC只在胞質(zhì)樣本檢測到酶活性。為進(jìn)一步確認(rèn)霍亂弧菌存在功能性Tat分泌系統(tǒng)，本研究對Tat基因簇中很可能為Tat功能基因的缺失株和回補(bǔ)株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)N169-dtatA(tatA單缺失株)、N169-dtatA2(tatA2單缺失株)及回補(bǔ)株N169-dtatABCA2-cp(pBAD24-tatA2BC)、N169-dtatABCA2-cp(pBAD24-tatABC)無論胞質(zhì)還是周質(zhì)酶活性檢測均為陽性，提示tatA或tatA2單基因缺失不導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失；而缺失株N169-dtatABCA2、N169-dtatABC、N169-dtatBC和回補(bǔ)株N169-dtatABCA2-cp(pBAD24-tatBC)只在胞質(zhì)樣本檢測到酶活性(圖2)，提示tatB和tatC是Tat系統(tǒng)功能必需基因。

C: Cytoplasm; P: Periplasm; 1: N169-dtatABCA2; 2: N169-dtatABC; 3: N169-dtatA; 4: N169-dtatA2; 5: N169-dtatABCA2-cp (pBAD24-tatBC); 6: N169-dtatBC; 7: N169-dtatABCA2-cp (pBAD24-tatA2BC); 8: N169-dtatABCA2-cp (pBAD24-tatABC).

3 討論

近年來，對Tat系統(tǒng)的研究越來越受到重視。Tat系統(tǒng)是存在于病原菌中并有重要毒力機(jī)制的特殊蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，參與細(xì)菌胞膜形成、生物膜形成、電子運(yùn)輸鏈排列、多種環(huán)境壓力下生存等。

霍亂弧菌Tat系統(tǒng)各基因編碼蛋白與大腸埃希菌對應(yīng)基因編碼蛋白的氨基酸同源性為43.3%～65.7% ，但霍亂弧菌Tat系統(tǒng)基因簇與大腸埃希菌Tat系統(tǒng)存在很多差異。(1)在霍亂弧菌Ⅰ號染色體沒有發(fā)現(xiàn)與大腸埃希菌tatE同源性高的基因片段；與大腸埃希菌tatE基因同源性高的基因tatA2(VCA0533)位于霍亂弧菌小染色體(Ⅱ號染色體)上，tatA2與大腸埃希菌tatA和tatE的同源性均很高。(2)霍亂弧菌Tat系統(tǒng)的主要基因位于霍亂弧菌的2個染色體上，Ⅰ號染色體tatA、tatB、tatC基因簇附近沒有tatD基因。(3)除Tat系統(tǒng)基因外，電子傳遞鏈和能量代謝相關(guān)基因〔細(xì)胞色素c551過氧化物酶基因(VC0089)和輔酶Q蛋白合成Aarf基因(VC0085)〕分別位于tatA、tatB、tatC操縱子的下游和上游。因此，研究霍亂弧菌Tat系統(tǒng)各基因的功能對研究Tat系統(tǒng)對霍亂弧菌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、致病力和環(huán)境生存作用是非常必要的。

本研究顯示，tatA或tatA2單基因缺失均不影響Tat系統(tǒng)功能；tatA和tatA2同時缺失，Tat系統(tǒng)功能受到影響，提示霍亂弧菌中tatA或tatA2兩者存一即可使Tat系統(tǒng)發(fā)揮功能，但不能同時缺少tatA和tatA2，顯示這2個基因是Tat系統(tǒng)功能發(fā)揮所必需的。這與大腸埃希菌tatA與tatE的功能可互相替換[16]相似，同時根據(jù)大腸埃希菌tatA、tatB、tatC基因簇與tatC基因的位置關(guān)系，初步判定霍亂弧菌的tatA2功能更接近大腸埃希菌的tatE。

tatB和tatC單基因缺失可導(dǎo)致霍亂弧菌Tat系統(tǒng)功能嚴(yán)重受損，因此初步判定它們是霍亂弧菌Tat系統(tǒng)的必需基因。這也與霍亂弧菌的tatB和tatC基因功能相似。分析大腸埃希菌Tat系統(tǒng)各組分的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)tatB缺失后，tatC會很快降解，所以tatB對維持tatC的穩(wěn)定性發(fā)揮重要作用[16]?；魜y弧菌tatB單基因缺失引起Tat系統(tǒng)功能受損是tatB缺失直接導(dǎo)致的，還是因?yàn)槠溆绊憈atC的穩(wěn)定性間接導(dǎo)致的，需進(jìn)一步研究。

本研究通過生物信息學(xué)分析和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，推測了霍亂弧菌編碼Tat系統(tǒng)的基因簇，驗(yàn)證了這些基因的生物學(xué)功能。結(jié)果提示，tatB和tatC是霍亂弧菌Tat系統(tǒng)功能必需的，tatA與tatA2基因功能重復(fù)，但整個Tat系統(tǒng)需要tatA或tatA2，兩者具備一個即可。由此推斷tatA-tatB-tatC或tatA2-tatB-tatC是霍亂弧菌Tat系統(tǒng)功能最小單位，為進(jìn)一步研究霍亂弧菌毒力及致病性相關(guān)功能基因提供了重要理論依據(jù)。

[1] Settles AM, Yonetani A, Baron A, Bush DR, Cline K, Martienssen R. Sec-independent protein translocation by the maize Hcf 106 protein [J]. Science, 1997, 278(5342): 1467-1470.

[2] Santini CL, Ize B, Chanal A, Müller M, Giordano G, Wu LF. A novel sec-independent periplasmic protein translocation pathway in Escherichia coli [J]. EMBO J, 1998, 17(1): 101-112.

[3] Berks BC, Sargent F, Palmer T. The Tat protein exports pathway [J]. Mol Microbiol, 2000, 35 (2): 260-274.

[4] Pradel N, Ye C, Livrelli V, Xu J, Joly B, Wu LF. Contribution of the twin arginine translocation system to the virulence of enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7 [J]. Infect Immun, 2003, 71(9): 4908-4916.

[5] Ding Z, Christie PJ. Agrobacterium tumefaciens twin-arginine dependent translocation is important for virulence，flagellation，and chemotaxis but not type Ⅳ secretion [J]. J Bacteriol, 2003, 185(3): 760-771.

[6] 張麗娟, 高守一, 景懷琦, 闞飆, 祁國明, 劉延清, 吳龍飛, 徐建國. 霍亂弧菌Tat 蛋白運(yùn)輸系統(tǒng)基因簇的確定與功能阻斷分析[J].遺傳學(xué)報, 2002, 29(10): 936-940.

[7] Robinson C, Bolhuis A. Tat-dependent protein targeting in prokaryotes and chloroplasts [J]. Biochim Biophys Acta, 2004, 1694(1-3):135-147.

[8] Müller M, Kl?sgen RB. The Tat pathway in bacteria and chloroplasts (review) [J]. Mol Membr Biol, 2005, 22(1-2): 113-121.

[9] Bogsch EG, Sangent F, Stanley NR, Berks BC, Robinson C, Palmer T. An essential component of a novel bacterial protein export system with homologues in plastids and mitochondria [J]. J Biol Chem, 1998, 273(29): 18003-18006.

[10] Stanley NR, Findlay K, Berks BC, Palmer T. Escherichia coli strains blocked in Tat-dependent protein export exhibit pleiotropic defects in the cell envelope [J]. J Bacteriol, 2001, 183(1): 139-144.

[11] Philippe N, Alcaraz JP, Coursange E, Geiselmann J, Schneidera D. Improvement of pCVD442, a suicide plasmid for gene allele exchange in bacteria [J]. Plasmid, 2004, 51(3): 246-255.

[12] Donnenberg MS, Kaper JB. Construction of an eae deletion mutant of enteropathogenic Escherichia coli by using a positive-selection suicide vector [J]. Infect Immun, 1991, 59(12): 4310-4317.

[13] Xiong Y, Santini CL, Kan B, Xu J, Filloux A, Wu LF. Expression level of heterologous tat genes is crucial for in vivo reconstitution of a functional Tat translocase in Escherichia coli [J]. Biochimie, 2007, 89(5):676-685.

[14] Kikuchi Y, Date M, Itaya H, Matsui K, Wu LF. Functional analysis of the twin-arginine translocation pathway in Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 [J]. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(11):7183-7192.

[15] Zhang L, Zhu Z, Jing H, Zhang J, Xiong Y, Yan M, Gao S, Wu LF, Xu J, Kan B. Pleiotropic effects of the twin-arginine translocation system on biofilm formation, colonization, and virulence in Vibrio cholera [J]. BMC Microbiol, 2009, 9:114.

[16] Sargent F, Stanley NR, Berks BC, Palmer T. Sec-independent protein translocation in Escherichia coli. A distinct and pivotal role for the TatB protein [J]. J Biol Chem, 1999, 274(51): 36073-36082.