喬明霞 劉 萍 徐 艷 李允廣

山東省棗莊市婦幼保健院 277102

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，IVF－ET已經(jīng)是治療不孕不育的重要手段，但是臨床的妊娠率仍然不高。一部分原因是由于在胚胎種植窗期，子宮內(nèi)膜由非接受態(tài)轉(zhuǎn)化為接受態(tài)的過程出現(xiàn)了異常。人們對(duì)該過程的確切調(diào)控機(jī)制知之甚少，而直接在體研究有很大的局限性，因此子宮內(nèi)膜體外培養(yǎng)體系的建立非常重要，對(duì)研究子宮的生殖生理具有重要意義。但是小鼠子宮較小，內(nèi)膜組織取材困難，純度不高，導(dǎo)致進(jìn)一步的培養(yǎng)發(fā)生困難，探討一種操作步驟簡(jiǎn)單、細(xì)胞損失少、純度高的新的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)非常必要。本文介紹一種相對(duì)簡(jiǎn)捷的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)昆明種成年雌性小白鼠（煙臺(tái)市綠葉制藥有限公司動(dòng)物中心提供）20只，8～10周齡，體重25～30g。雌雄按2∶1比例合籠，次晨檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓者記做妊娠第1天。

1.2 設(shè)備和試劑 （1）主要設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Forma3131）、Olympus倒置顯微鏡（日本）、200目篩網(wǎng)、離心機(jī)（Eppendorf5702）、超凈工作臺(tái)（青島Haier集團(tuán)公司）。（2）試劑：DMEM／F12高糖培養(yǎng)液（Hyclone公司）、胎牛血清（FCS，Gibco公司）、膠原酶Ⅰ（Gibco公司）、雙抗（Hyclone公司）、兔抗鼠角蛋白抗體、兔抗鼠波形蛋白抗體、鏈霉素生物素－過氧化物酶（SP）標(biāo)記的羊抗兔免疫組化試劑盒（均為北京中山金橋生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 妊娠第4天雌鼠斷頸處死，迅速無菌取出子宮，置于含雙抗的DMEM／F12（4℃預(yù)冷）的3.5cm培養(yǎng)皿中，去除脂肪后，再次用含雙抗的DMEM／F12培養(yǎng)液沖洗子宮兩遍，取彎折成90°的20ml注射器針頭用擠壓法擠出小鼠子宮內(nèi)膜組織。將子宮內(nèi)膜剪成細(xì)顆粒狀組織塊。用2g／ml的膠原酶Ⅰ按3∶1混合，37℃培養(yǎng)箱消化150min。以含血清的DMEM／F12培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打后收集培養(yǎng)液，200目濾網(wǎng)過濾將組織棄去。1 000r／min離心10min收集內(nèi)膜細(xì)胞沉淀。吸去上清液，加少許含10%FCS的培養(yǎng)液輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度，以1×105／ml的密度接種于6孔培養(yǎng)板（培養(yǎng)板孔內(nèi)放有多聚賴氨酸包被的蓋玻片），置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況 ，隔日更換細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.3.2 細(xì)胞的免疫化學(xué)染色：待細(xì)胞生長(zhǎng)成單層后取出玻片，預(yù)冷的PBS漂洗，4%多聚甲醛室溫下固定20min，PBS沖洗；3%的H2O2室溫下孵育15min，PBS沖洗；10%的正常羊血清37℃封閉30min；加一抗（波形蛋白抗體、角蛋白抗體）稀釋濃度為1∶200，4℃過夜孵育；二抗（SP標(biāo)記的羊抗兔IgG）即用型工作液，37℃孵育30min；PBS沖洗，DAB顯色；蘇木精復(fù)染；鹽酸酒精分色；中性樹膠封片。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗，其他步驟相同。高倍鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞陽性率。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征 倒置顯微鏡下觀察基質(zhì)細(xì)胞平鋪生長(zhǎng)呈單個(gè)分散細(xì)胞，在接種30min貼壁。細(xì)胞呈多角形或者梭形。多角形細(xì)胞胞漿薄而透明，有多個(gè)短小突起。消化后的腺上皮細(xì)胞呈管狀或葡萄狀，在接種24h后已貼壁。成團(tuán)生長(zhǎng)，培養(yǎng)2d后腺上皮細(xì)胞長(zhǎng)成鋪路石樣的單層細(xì)胞集落排列緊密，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央。

2.2 細(xì)胞鑒定及純度檢測(cè) 采用對(duì)上皮細(xì)胞特異的細(xì)胞角蛋白18抗體和對(duì)基質(zhì)細(xì)胞特異的波形蛋白抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞角蛋白染色陽性，胞質(zhì)被染成棕色，核呈藍(lán)色，陽性率約96%（見圖1，腺上皮細(xì)胞角蛋白－18染色陽性）?；|(zhì)細(xì)胞波形蛋白染色胞質(zhì)也呈棕色，陽性率達(dá)93%（見圖2，基質(zhì)細(xì)胞波形蛋白染色陽性）。

3 討論

圖1 腺上皮細(xì)胞（×200）

圖2 基質(zhì)細(xì)胞（×400）

本研究結(jié)果表明，運(yùn)用擠壓法和酶消化法相結(jié)合，可以成功地培養(yǎng)出圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。用擠壓法［1］可以完整分離出圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜。膠原酶Ⅰ消化作用溫和緩慢，消化后獲得的細(xì)胞比胰蛋白酶消化后獲得的細(xì)胞活力高。本研究采用二者結(jié)合培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞，不但使子宮內(nèi)膜細(xì)胞純度提高，而且增加了細(xì)胞的活力。子宮內(nèi)膜細(xì)胞由單層柱狀腺上皮細(xì)胞和固有層基質(zhì)細(xì)胞組成，兩者相互作用，相互影響，腺上皮和基質(zhì)細(xì)胞均受卵巢激素的影響產(chǎn)生周期性的變化，基質(zhì)細(xì)胞具有旁分泌功能，其產(chǎn)生的酶類、功能蛋白和細(xì)胞因子調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞的分化、增殖。Kleinman［2］研究表明基質(zhì)是子宮腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的必要條件，Arnold［3］提出基質(zhì)細(xì)胞可能參與雌激素對(duì)上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。所以將腺上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，以發(fā)揮兩者的協(xié)同作用。對(duì)進(jìn)一步研究小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生物活性和各種因素的調(diào)節(jié)作用以及建立與胚胎的共培養(yǎng)體系等具有重大意義。

［1］ 譚毅，顧美禮，王智彪，等.完整分離圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜方法的建立〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2001，9（1）：40－44.

［2］ Kleinman HK，McGarvey ML，Hassell JR，et al.Basement membrane complexes with biological activity〔J〕.Biochemistry，1986，25：312.

［3］ Arnold JT，Kaufman DG，Seppala M，et al.Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro：a new co－culture model〔J〕.Hum Reprod，2001，16：836.