潘振華 綜述 周清華 審校

Goodell等[1]在研究小鼠骨髓細胞中造血干細胞的特性時發(fā)現(xiàn)這樣一群細胞：當以熒光染料Hoechst 33342標記時，雙波長二維流式細胞散點圖上會出現(xiàn)一小群Hoechst 33342低染的細胞，試驗發(fā)現(xiàn)，與整體骨髓細胞相比，這群細胞富集了造血干細胞活性的細胞，他們命名這部分細胞為側群細胞，即SP（side population）細胞。之后，在許多組織器官的干細胞和腫瘤細胞中都檢測出了含量很少的SP細胞，這些SP細胞也都相應地具備干細胞的多種特性，被認為是一個濃縮的干細胞群體[2-6]。2005年，Kim等從支氣管和肺泡導管交界處分離出了支氣管肺泡干細胞（bronchial alveolar stem cells, BASCs），BASCs表現(xiàn)出明顯的自我更新特性，能夠分化為其它類型的肺上皮細胞，當體內(nèi)支氣管和肺泡損傷時，BASCs能夠分化為終末細支氣管上皮細胞（Clara細胞）、I型肺泡上皮細胞和II型肺泡上皮細胞，研究[7]還發(fā)現(xiàn)，K-ras基因突變活化可引起B(yǎng)ASCs增殖，提示BASCs可能是肺腺癌的起源細胞，這一研究結果更是激起了人們探尋肺癌腫瘤干細胞的興趣。2007年，Ho等[8]從包括A549在內(nèi)的6種人肺癌細胞系和腫瘤組織中分離出了SP細胞，并試驗驗證了這些SP細胞具有類干細胞特性，提出采用SP表型可以分離純化得到肺癌腫瘤起源性細胞。目前分離腫瘤干細胞的方法主要包括根據(jù)特異性分子標記物分選和根據(jù)SP細胞表型進行分選[9]，而肺癌腫瘤干細胞的特異性表面標記尚未得到確認，肺癌SP細胞的分離和鑒定很有可能為肺癌腫瘤干細胞的研究提供便利的途徑，本文將就肺癌SP細胞對于研究肺癌腫瘤干細胞的意義進行階段性綜述。

1 肺癌SP細胞的干細胞特性驗證

Patrawala等[3]總結出干細胞的本質(zhì)特性包括：①通常所占比例都很低；②盡管具有很強的繁衍潛能，但在正常微環(huán)境中基本不分化；③能實現(xiàn)自我復制；④具有多向分化的能力；⑤能表達特殊標記物或生物特征以實現(xiàn)識別與富集。近來研究者已先后在A549、H460、H23、H441、H2170、HTB-58、H446和SPC-A1等多種人肺癌細胞株中分選得到了SP細胞，它們占總細胞比例的1.1%-6.3%，并且90%以上都處于G0期-G1期。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，這些肺癌SP細胞能夠以非對稱方式分化產(chǎn)生SP細胞與非SP細胞，且分化增殖后SP細胞占總細胞的比例與分選前原細胞中SP細胞比例相近，非SP細胞則只能增殖而不能分化產(chǎn)生SP細胞。裸鼠接種試驗[8,10-12]結果表明，與非SP細胞和整體細胞相比，接種SP細胞的成瘤率提高了幾十倍甚至幾百倍。對從A549細胞中分選出的SP細胞進行microRNA分析，發(fā)現(xiàn)其表達譜與非SP細胞有著明顯差異，SP細胞的microRNA表達豐度要遠低于非SP細胞，這符合干細胞microRNA的表達隨著分化的進行而逐漸增高的結論[13]。

2 ABCG2/Bcrp1對研究肺癌SP細胞和肺癌腫瘤干細胞的意義

現(xiàn)有研究[2,4,14]已證實，細胞排出染料Hoechst 33342從而表現(xiàn)出SP表型的能力與ABC轉運蛋白家族有關，特別是ABCG2/Bcrp1基因與SP表型直接相關，在Bcrp1-/-小鼠的骨髓細胞中，SP表型缺失。ABCG2/Bcrp1基因是導致細胞在傳統(tǒng)化療過程中產(chǎn)生多藥耐藥性的主要轉運子之一，與腫瘤干細胞的強抗藥性特征相符，那么該基因是否可以作為肺癌腫瘤干細胞的特異性標志物呢？試驗結果發(fā)現(xiàn)，在Bcrp1-/-小鼠的骨髓細胞中，雖然SP表型缺失，但是造血干細胞的數(shù)量與功能仍然維系在正常水平，這一發(fā)現(xiàn)提示，即使Bcrp1能夠作為HSCs的一個標記物，但對其干細胞的功能并無直接影響[14]。Patrawala等[3]通過對30多種腫瘤細胞系進行反復試驗驗證，得出如下結論：雖然腫瘤細胞中的SP細胞群較非SP細胞群成瘤性強，但ABCG2+細胞和ABCG2-細胞的成瘤性并無明顯差異。Zhou等[15]報道了關于小鼠肺組織中的SP細胞分布和Bcrp1表達的研究，研究結果指出，雖然SP細胞高表達Bcrp1，但并不是所有表達Bcrp1的細胞都具有SP表型。牛等[16]也通過免疫組化方法觀察了ABCG2在肺癌組織及肺癌細胞系GLC-82和A549中的表達，發(fā)現(xiàn)在大細胞和小細胞癌組織中基本未檢出ABCG2，而在肺腺癌和肺鱗癌組織中ABCG2呈彌漫性陽性分布，在兩株細胞系中ABCG2也幾乎100%陽性表達，可見ABCG2/Bcrp1雖然與細胞的SP表型直接相關，但是單獨并不能作為肺癌腫瘤干細胞的篩選標記。

此外，朱等[17]的另一發(fā)現(xiàn)對于研究ABC轉運蛋白與SP表型以及SP表型細胞的高腫瘤干細胞特性之間的關系也很有意義，他們在SPC-A1/Docetaxel細胞中檢測出了較SPC-A1細胞更高比例的SP細胞，但前者中的SP細胞在增殖能力、克隆形成能力以及致瘤性方面都比后者中的SP細胞要低，他們分析認為，前者細胞中的高比例SP細胞主要是由于經(jīng)過了藥物篩選從而高表達ABC轉運蛋白所致，而非全部由天然高表達ABC轉運蛋白的腫瘤干細胞產(chǎn)生。由此提示，并不是任何情況下得到的SP表型細胞都能成為腫瘤干細胞的富集。

3 肺癌腫瘤干細胞標志物的研究現(xiàn)狀

CD133是細胞表面蛋白超家族中的一員，已在乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、結腸癌和前列腺癌等多種實體瘤中被用作腫瘤干細胞標志物[9]。Eramo等[18]從小細胞和非小細胞肺癌組織和細胞系中分離得到了一小部分含量極少的CD133+細胞，通過試驗他們發(fā)現(xiàn)，這些細胞具有自我復制和多向分化的能力，在無血清培養(yǎng)基中能夠無限增殖，當以104數(shù)量級對免疫缺陷小鼠進行接種時即能發(fā)展成為同型瘤體，他們認為這部分未分化的肺癌CD133+細胞就是肺癌的腫瘤源性細胞。而Meng等[19]的研究結果顯示，肺腺癌細胞A549和小細胞肺癌細胞H446中的CD133+細胞和CD133-細胞中肺癌腫瘤干細胞含量相似，它們無論在體外克隆、細胞的自我更新和分化，還是體內(nèi)成瘤和侵襲，以及對化療藥物的耐藥性等各方面的實驗結果并無明顯差異。錢等[20]的研究結果也發(fā)現(xiàn)，CD133+細胞在人肺腺癌組織、癌旁組織和正常肺組織中廣泛分布，其數(shù)量在三者之間無統(tǒng)計學差異。

越來越多的研究[9]發(fā)現(xiàn)，以CD133為代表的單個標記物應用于肺癌腫瘤干細胞的分離與鑒別具有較大的局限性，而多個表面標記物聯(lián)合則有助于提高鑒別的特異性及靈敏度。例如，Kim等[7]發(fā)現(xiàn)肺腺癌可能的起源細胞BASCs表達Sca-1+CD45-PECAM-CD34+，Levina等[21]將肺癌細胞株H460通過阿霉素、順鉑、依托泊苷處理后得到的藥物生存細胞（drug surviving cells, DSCs）培養(yǎng)后能形成新的克隆，試驗鑒定這些DSCs具有高成瘤高轉移等腫瘤干細胞特性，它們除了高表達CD133、CD117和OCT-4等干細胞標記物，還高表達VEGF、bFGF、IL-6、IL-8和受體VEGFR2、FGFR2等。Gutova等[22,23]則應用干細胞標記物CD34、CD90、CD133、ABCG2/Bcrp1來分離小細胞肺癌腫瘤干細胞。

4 小結

由上文的綜述可見，關于肺癌腫瘤干細胞的特異性標志物到目前為止還沒有得到統(tǒng)一的確認，雖然ABCG2/Bcrp1是決定細胞SP表型的重要基因，但并不是表達該基因的肺癌細胞都具有SP表型，它既不能直接影響肺癌SP細胞的干細胞活性，也不能單獨作為肺癌腫瘤干細胞的標志物。同樣，也并不是所有的肺癌SP細胞都是肺癌腫瘤干細胞。Challen等[2]提出，在缺乏確定的細胞表面標志的情況下，SP表型對于某些組織干細胞而言可能并不是很有效的分離標志，并且從不同器官分離的SP細胞具有異質(zhì)性，只有在明確的證明單個SP細胞能分化為多個起源于特定組織的細胞時，組織特異性SP細胞才能被認為是干細胞。

不過，由于SP細胞具有廣泛性和表型上的保守性，還是很有可能成為肺癌腫瘤干細胞研究的理想模型。以肺癌SP細胞作為研究模型，應用微陣列分析等高通量分子生物信息學手段比較肺癌細胞中的SP細胞與正常肺組織干細胞的SP細胞基因表達的差異，對于尋找肺癌腫瘤干細胞特有的標志物有重要意義。依靠特異性標志物不僅能有效減少甚至杜絕化療時的嚴重毒副作用，同時也將為肺癌的早期診斷和預后奠定基礎。