李慧 崔洪霞 綜述 程穎 審校

肺癌是我國發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，手術、化療、放療及分子靶向治療使肺癌的治療有了很大的提高，但其5年總生存率仍徘徊在10%-15%。源于肺癌腫瘤細胞的不斷增殖，通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT）等形態(tài)學變化，細胞會分泌胞外酶降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM），造成細胞間及細胞與周圍基質(zhì)間相互附著力下降，從而利于腫瘤細胞逃離組織束縛進入循環(huán)系統(tǒng)，成為具有侵襲轉(zhuǎn)移能力的CTCs[1]。近年來隨著腫瘤的研究和治療技術的提高，發(fā)現(xiàn)許多腫瘤患者雖然在治療后臨床上檢測不到殘余的腫瘤細胞，但最終患者因腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移而死亡，這可能與單獨用影像學技術不能檢測到微小殘留腫瘤細胞有關。這些細胞存在于外周血、骨髓、淋巴結中，在一定條件下增殖浸潤，引起腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移。這些復發(fā)、轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞表型和表達譜與原發(fā)灶相似，因此CTCs作為一種代表原發(fā)腫瘤的“液態(tài)活檢標本”為肺癌患者實施實時、無創(chuàng)性檢測提供了資源。而且研究[2-6]發(fā)現(xiàn)檢測CTCs有助于肺癌的早期診斷、監(jiān)測復發(fā)與轉(zhuǎn)移、判定療效、制訂個體化治療方案及判斷預后。

目前隨著對肺癌驅(qū)動基因、癌基因、抑癌基因等基因組學的研究以及對腫瘤生物標志物表達、缺失、差異性表達的研究，使肺癌治療進入了針對分子標志物化療、靶向治療的時代。但目前我們面臨的是如何提高藥物療效并減少毒性反應、如何克服耐藥性以及解決腫瘤異質(zhì)性問題，這些難題的攻克均需要我們提供組織標本。但單次組織活檢由于受腫瘤的基因組變異引起的異質(zhì)性影響，可能會造成個體化診斷和分子標志物分析的偏差。特別是在腫瘤的進展轉(zhuǎn)移過程中，如何檢測與轉(zhuǎn)移或耐藥相關的新的分子變異很重要。目前開展實時活檢在臨床中難以被患者接受，但隨著基因組技術的進步，特別是CTCs的研究進展，未來理想有可能變?yōu)楝F(xiàn)實。

1 CTCs的檢測方法

盡管在多種腫瘤患者的外周血中能夠檢測到CTCs，但總體上來說，血液中CTCs的數(shù)量非常少，而且在不同腫瘤患者之間或是同一腫瘤的不同患者之間CTCs數(shù)目具有較大差異。目前的主流理念是先對外周血中的腫瘤細胞進行富集，然后對其進行檢測。富集方法主要是利用腫瘤細胞獨特的表面標志或物理特性來進行。后續(xù)的檢測包括基因水平的檢測或細胞水平的檢測，其中基因水平檢測的方法主要是實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR （quantitative reverse-transcription PCR, qRT-PCR），細胞水平的檢測方法有流式細胞檢測技術（fluocytometry, FCM）、Cellsearch、CTC芯片（CTC-chip）和膜濾過分離腫瘤細胞技術（isolation by size of epithelial tumor cells, ISET）等。各種方法各有其優(yōu)缺點。

1.1 qRT-PCR法 秉承了PCR技術的靈敏度，可在1×107個-1×108個外周血細胞中檢測出單個腫瘤細胞，但該方法是通過腫瘤標志物的含量推測CTCs的數(shù)目，并不能真實反映CTCs的個數(shù)。因為不同的CTCs之間腫瘤標志物的表達水平不同，因而腫瘤標志物的含量與腫瘤細胞的實際個數(shù)并不總是具有正相關性[7]。

1.2 FCM法 采用熒光標記相應抗體來檢測CTCs，其優(yōu)點是操作簡單、快速、數(shù)據(jù)精確。缺點是FCM不能提供細胞形態(tài)方面的信息，無法區(qū)分帶有同樣標志物的腫瘤細胞和正常細胞。由于FCM檢測靶細胞的敏感度僅為1/10萬，而外周血中腫瘤細胞的數(shù)量常少于1/100萬，因此該方法的價值在很大程度上依賴于可分析的細胞數(shù)量，極大地限制了該技術的廣泛應用[8]。

1.3 Cellsearch法 Cellsearch系統(tǒng)是將細胞富集后再進行自動化檢測，其生物學原理是依據(jù)腫瘤細胞與正常細胞表達的表面蛋白不同而將二者區(qū)分開來。來源于中胚層的白細胞表達CD45，來源于外胚層的癌細胞表達上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）和細胞角蛋白（cytokeratin, CK），但不表達CD45。該系統(tǒng)首先通過正選擇將血液中表達EpCAM的細胞分離出來，然后進行免疫熒光染色，將EpCAM+CK+DAPI+CD45-的細胞界定為CTCs。應用Cellsearch系統(tǒng)可以檢測7.5 mL的血液樣本（約含400多億的血細胞）中單一的CTCs，因此具有敏感度高、可操作性強、高度自動化檢測、數(shù)據(jù)精準等優(yōu)點。但該檢測系統(tǒng)會遺漏缺失上皮細胞表面標志的腫瘤細胞，例如經(jīng)過EMT后的間質(zhì)細胞。此外，在檢測團塊狀的CTCs方面也不具有優(yōu)勢[9]。

1.4 CTC-chip法 CTC-chip技術的生物學原理與Cellsearch基本相同，也是將CTCs認定為帶有EpCAM和CK的表達但不帶有CD45表達的細胞群。CTC-chip技術具有更高的靈敏性，可以在1 mL血液中檢測出循環(huán)腫瘤細胞。第一代的CTCs芯片是基于微流體學原理，在硅片上面覆蓋眾多的顯微位點，每一個位點上都包被著能夠捕獲CTCs的抗體。當血液樣品通過微流芯片時，CTCs就能被捕獲到[4]。因為第一代的CTCs芯片僅適用于小規(guī)模的實驗室研究，而不能應用于大規(guī)模的臨床研究，第二代的CTCs芯片又名herringbone（HB）芯片應運而生。改進之處在于將微芯片安裝在標準載玻片上，不但可以利用常規(guī)病理檢測方法對癌細胞進行鑒別，也加大了樣本的處理量并提高了捕獲團塊狀CTCs的能力[10]。

1.5 ISET法 ISET聯(lián)合激光掃描細胞計量儀技術的原理是首先利用上皮源性的腫瘤細胞比血液中的其它細胞大的特性，采用孔徑為8 μm的濾膜，將腫瘤細胞從血液中分離出來，然后通過熒光標記細胞來進行進一步鑒定，常用的熒光抗體包括抗CK抗體或者抗lineage-specific抗體。采用此方法已成功地在乳腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的外周血中檢測出CTCs[11]。但采用此方法檢測的CTCs數(shù)目與采用Cellsearch技術檢測的數(shù)目之間存在不一致性，可能有假陽性結果出現(xiàn)[12]。該方法的優(yōu)勢之一是可以將失去上皮細胞特征的腫瘤細胞分離出來，例如經(jīng)過EMT的間質(zhì)細胞等。

2 CTCs在肺癌中的臨床應用

2.1 CTCs與肺癌早期診斷 肺癌的早期診斷對治療效果至關重要，早期發(fā)現(xiàn)并及時治療是提高生存率的關鍵。研究[3,13]顯示CTCs對肺癌早期診斷具有潛在的應用價值。目前，在無明顯臨床癥狀和轉(zhuǎn)移灶的I期患者體內(nèi)也可檢測到CTCs，說明現(xiàn)有臨床分期的早期就已存在肺癌細胞的播散[14]，并能在大量聚集后形成具有高度轉(zhuǎn)移潛能的循環(huán)腫瘤微栓。

Allard等[15]最先采用Cellsearch系統(tǒng)檢測了99例肺癌患者（主要是NSCLC）的168個樣品，發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血中CTCs數(shù)目≥2、≥5、≥10和≥50的患者分別占總患者的20%、14%、10%和6%。隨后Nagrath等[4]采用CTC-chip檢測了55例肺癌患者外周血中CTCs，結果顯示所有患者的血液中均檢測出5個以上的腫瘤細胞，其中每毫升血液中CTCs數(shù)目為5-20、21-50、51-100和＞100的陽性率分別為20%、20%、20%及40%。2009年后關于肺癌患者外周血中CTCs的論文不斷涌現(xiàn)。Wu等[16]檢測了47例肺癌患者，其中41例為初治患者，6例為復發(fā)患者；3例為I期-II期，22例為III期，22例為IV期；按病理類型可分為腺癌27例，鱗癌7例，小細胞肺癌（small-cell lung cancer, SCLC）13例。結果顯示每7.5 mL血液中CTCs數(shù)目≥2的患者在初治的III期腺癌中為78%，III期鱗癌中為75%，III期SCLC中為60%，在IV期腺癌和IV期SCLC中，CTCs陽性率分別為46%和71%，復發(fā)的患者CTCs陽性率高達83%。

2.2 CTCs與肺癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移 肺癌的復發(fā)、轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的重要原因，而外周血中存活的腫瘤細胞可能是造成肺癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)的機制之一。因此研究CTCs的生物學特性可以為抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和復發(fā)提供有價值的理論依據(jù)。

日本的Tanaka等[5]檢測了125例肺癌患者外周血中的CTCs，其中包括85例腺癌，22例鱗癌，9例SCLC，9例其它病理類型的肺癌。結果顯示在30.6%的肺癌患者中檢測到CTCs，但在12%的非惡性腫瘤患者（n=25）中也發(fā)現(xiàn)相同表型的細胞，統(tǒng)計學分析結果表明CTCs數(shù)目間的差異不足以區(qū)分肺癌和非惡性腫瘤。在納入該研究的患者中，31例伴有遠處轉(zhuǎn)移，94例無遠處轉(zhuǎn)移。進一步分析發(fā)現(xiàn)CTCs水平與腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移具有相關性，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者體內(nèi)CTCs數(shù)目升高，檢測出CTCs＞1的敏感性和特異性分別為71%和83%。通過該研究作者認為CTCs是一個有用的、可監(jiān)測肺癌轉(zhuǎn)移的生物標志物。

2.3 CTCs與肺癌療效 當前對肺癌的治療是基于腫瘤病理分級、患者一般狀況及腫瘤發(fā)展趨勢等因素之上的綜合治療。但遵循統(tǒng)一的診斷標準建立的治療方案缺乏個體化。隨著對CTCs研究的深入，發(fā)現(xiàn)其可反映腫瘤組織基因的表達變化，有助于監(jiān)測療效及建立個體化的治療方案。

Nagrath等[4]發(fā)現(xiàn)在評估化療的療效上，CTCs數(shù)量的改變與按照實體瘤的療效評價標準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）進行計算機斷層掃描（computed tomography, CT）檢查的結果具有高度一致性。Wu等[16]應用Cellsearch對12例化療2個周期的肺癌患者跟蹤隨訪，也發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量與化療后影像學的應答存在相關性，提示CTCs可實時監(jiān)測肺癌患者化療的療效。

采用CTCs作為生物標志物預測藥物療效的一項II期臨床試驗[17]正在進行。該研究納入了39例復發(fā)和耐藥的SCLC患者，采用替莫唑胺治療前，患者CTCs為0-929，7例為0，13例為1-4，19例≥5；存在肝轉(zhuǎn)移的患者較非轉(zhuǎn)移患者CTCs數(shù)目更高；出現(xiàn)新轉(zhuǎn)移灶的患者較原有病灶進展的患者CTCs水平高（P=0.008）；治療第1周期末的CTCs數(shù)目與采用RECIST進行的療效評價結果具有相關性（P=0.041），CTCs增高的患者總生存期（overall survival, OS）縮短（5個月 vs 8個月），但是基線CTCs不能預測治療反應，也不能預測無進展生存期（progression free survival, PFS）。

肺癌組織基因的表達或突變可在治療過程中發(fā)生變化，從而導致藥物敏感性的改變，如耐藥基因T790M的出現(xiàn)可導致初始對吉非替尼敏感的NSCLC患者的治療失敗。Maheswaran等[6]檢測了接受吉非替尼治療的NSCLC患者的CTCs中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）突變情況，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤組織具有高度一致性，例如同樣存在T790M突變。在治療過程中監(jiān)測CTCs，發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)量的改變可以反映患者病情的變化趨勢和治療的療效。

2.4 CTCs與肺癌預后 在肺癌患者中，CTCs數(shù)目與腫瘤進展呈正相關，尤其伴隨腫瘤遠處轉(zhuǎn)移而升高。因此，對肺癌CTCs研究顯示CTCs具有重要的預后價值[5,18,19]。

英國的Hou等[18]檢測了50例SCLC患者（20例局限期和30例廣泛期）外周血中的CTCs，這些患者都是初次應用化療藥物（如鉑類聯(lián)合依托泊苷），放療和預防性腦照射在第2個化療周期開始并與化療同時進行或是在第6個化療周期后進行，在第1個療程的第1天及第15天進行早期療效評估。化療前86%的患者中檢測到CTCs，經(jīng)過化療后患者CTCs陽性率下降至60%。在化療后第22天時檢測到的中位CTCs為1，持續(xù)升高的CTCs預示著患者的預后差（P=0.01）。進一步對15例樣本（CTCs數(shù)目為0-5,884）進行分析后發(fā)現(xiàn)，所有被檢測出CTCs的樣本中均可見CD56陽性細胞。CD56屬于神經(jīng)粘附分子且在小細胞肺癌中高表達，因此該數(shù)據(jù)說明循環(huán)血液中的CTCs具有與組織中原發(fā)腫瘤相似的特性，即具有上皮-神經(jīng)內(nèi)分泌的雙重特征。此外，CTCs的水平與病理分期及功能狀態(tài)評分相關。廣泛期患者的中位CTCs為237，局限期為2，7例未檢測到CTCs的患者均為局限期患者。CTCs的數(shù)量也與肝轉(zhuǎn)移成正相關，肝轉(zhuǎn)移患者與非轉(zhuǎn)移患者中位CTCs分別為1,197和4。CTCs水平與患者的生存相關，是一個預后因子，CTCs數(shù)目＞300的患者中位生存時間為134 d，CTCs數(shù)目＜2的患者中位生存時間為443 d（P＜0.005）。該研究報道的CTCs陽性率明顯高于Allard等報道的陽性率（86% vs 20%），作者分析這與SCLC增殖快、轉(zhuǎn)移發(fā)生得早及惡性度高有關。隨后，該研究小組擴大了檢測的人群[20]，通過分析97例SCLC患者，發(fā)現(xiàn)85%患者外周血中存在CTCs。化療前CTCs數(shù)目≥50的患者和＜50的患者相比，OS分別為5.4個月和11.5個月（P=0.002） ，這證明基線CTCs數(shù)量是SCLC獨立的預后因素。通過探索性分析53例患者在治療前后CTCs數(shù)目的變化，研究人員還發(fā)現(xiàn)CTCs數(shù)目變化是預測生存最明顯的變量（在調(diào)整了基線CTCs水平和其它的臨床預后因子后），化療1周期后CTCs數(shù)目不能降低到50以下的患者預后不良。

對于晚期NSCLC患者，研究人員[21]發(fā)現(xiàn)IV期患者血液中CTCs數(shù)目為0-146，IIIb期為0-3，而IIIa期檢測不到CTCs。化療前CTCs數(shù)目＜5和≥5的患者的PFS分別是6.8個月和2.4個月，OS分別是8.1個月和4.3個月，多因素分析結果顯示CTCs數(shù)目是最強的預測NSCLC總生存期的指標（P＜0.001），如果聯(lián)合參考治療前（基線）和第1次化療結束后外周血中CTCs數(shù)目，危險比值更高（P＜0.001）。Das等[22]研究了17例轉(zhuǎn)移性NSCLC患者CTCs中切除修復交叉互補基因1（excision repair cross complementation1, ERCC1）的表達與預后的相關性。入組患者的特征包括：接受過鉑類為基礎的化療；CTCs數(shù)目≥2；可檢測到ERCC1表達。結果顯示以ERCC1表達水平1為臨界值，無ERCC1表達的患者PFS延長，ERCC1表達水平高的患者PFS縮短（266 d vs 172 d, P＜0.02）。

3 問題與展望

已有大量臨床試驗表明，腫瘤細胞脫落、侵襲并進入血液循環(huán)是實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的最初階段，CTCs具有重要臨床意義。但目前CTCs檢測的臨床應用仍存在諸多問題：①如何提高檢測方法和分子標志物的敏感性和特異性；②多少個CTCs能夠代表腫瘤病灶的特征；③陰性結果中尚不能完全排除發(fā)生播散的陰性表達細胞，部分檢測陰性的患者也在近期出現(xiàn)腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移；④檢測的合適時間該如何選擇，或者對CTCs陽性患者如何綜合治療。此外原發(fā)腫瘤細胞進入外周血循環(huán)后是否基因表型與原發(fā)腫瘤完全一致仍需進一步研究來論證。

雖然CTCs檢測存在一系列問題，且對CTCs的研究多集中在CTCs數(shù)量分析上，但CTCs作為新的檢測手段，其在腫瘤早期診斷、檢測復發(fā)、轉(zhuǎn)移、判定療效和預后等方面的重要作用已得到了大量研究證實[23-25]。而且有學者開始關注CTCs本身的差別，如CTCs表面的蛋白表達或其基因突變與臨床的關系。目前個體腫瘤間生物學特性的差異是個體化治療的基礎，如分子亞型指導下肺腺癌中檢測EGFR、磷脂酰肌醇激酶-3 （phosphoinositide-3-kinase, catalytic, alpha polypeptide, PIK3CA）、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、c-Met等基因變異的個體化治療。而個體內(nèi)的瘤內(nèi)異質(zhì)性可能是敏感性差異和獲得性耐藥的原因之一，因此腫瘤異質(zhì)性是我們目前面臨的難題；另外探討最關鍵的分子通路和探尋新的分子標志物是未來的研究重點。CTCs被視為替代原發(fā)腫瘤“液體活檢標本”，可能有助于臨床分子檢測、分析耐藥分子機制及解決腫瘤異質(zhì)性的問題。