盧文藝，趙明峰

天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院 天津市第一中心醫(yī)院血液科，天津300192

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)來(lái)源于非造血基質(zhì)組織的前體細(xì)胞，它具有干細(xì)胞特性和多向分化能力，在嚴(yán)格控制的培養(yǎng)環(huán)境中可以分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和肝細(xì)胞等，同時(shí)也具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力［1］。由于MSCs具有這種多向分化能力以及免疫調(diào)節(jié)特性，其在干細(xì)胞治療和組織工程學(xué)上的應(yīng)用潛力越來(lái)越受到人們的關(guān)注［2］。氧化應(yīng)激作為機(jī)體常見(jiàn)的生理調(diào)節(jié)機(jī)制，在MSCs的各種病理狀態(tài)下起著至關(guān)重要的作用，許多研究都在致力于探索氧化應(yīng)激對(duì)MSCs的作用機(jī)制。本文就氧化應(yīng)激對(duì)MSCs影響的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

骨髓MSCs的特點(diǎn)及功能

骨髓MSCs具有CD45-CD44+CD105+免疫表型，且與造血干細(xì)胞類似，它具有自我更新和多向分化能力，是非造血基質(zhì)組織的前體細(xì)胞，可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和構(gòu)建造血微環(huán)境來(lái)支持造血干細(xì)胞的擴(kuò)增［3］。骨髓 MSCs可以直接分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞是造血微環(huán)境最重要的組成部分，其表面的N-鈣黏蛋白和造血干細(xì)胞發(fā)生同型相互作用后介導(dǎo)造血干細(xì)胞定位到造血干細(xì)胞龕中［4］。骨髓MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)特性，可通過(guò)影響T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能［5-6］。目前有關(guān)骨髓MSCs抑制T淋巴細(xì)胞的研究比較多，其作用方式可能主要通過(guò)以下3種途徑:(1)MSCs可能具有“否決”樣細(xì)胞 (veto cell)活性或間接通過(guò)否決細(xì)胞激活下游抑制信號(hào)來(lái)抑制T細(xì)胞;(2)通過(guò)激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮作用;(3)MSCs誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性或通過(guò)細(xì)胞接觸、細(xì)胞因子及凋亡途徑等來(lái)抑制其功能［6］。

氧化應(yīng)激及其病理生理機(jī)制

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧 (reactive oxygen species，ROS)的生成增加和/或清除ROS的能力降低，導(dǎo)致ROS的生成和清除失衡，過(guò)量的ROS可引起生物大分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷。ROS由O2-、OH、HO2、RO2、RO等極性分子以及H2O2、O2等非極性分子構(gòu)成，主要通過(guò)NADPH氧化酶途徑和線粒體電子傳遞鏈途徑生成［7］。為了阻止ROS的聚集，細(xì)胞內(nèi)還存在多種抗氧化系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶以及一些保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷的氧化敏感型分子硫氧化還原蛋白、脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子-1(apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor 1，APE/REF-1)。ROS的大量聚集改變了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，通過(guò)氧化DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子，對(duì)細(xì)胞、組織和器官造成損害。過(guò)量的ROS通過(guò)增加線粒體外膜的滲透性，誘導(dǎo)線粒體滲透性轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等促凋亡因子漏出，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。ROS還可通過(guò)增加端粒的損耗，使細(xì)胞周期停滯、加速細(xì)胞衰老。另外，ROS可觸發(fā)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如AKT、p38絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)、p53，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡等不同反應(yīng)。

氧化應(yīng)激對(duì)骨髓MSCs的影響

作為影響細(xì)胞存活的重要因素之一，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)骨髓MSCs的衰老及凋亡，阻礙其增殖并向成骨細(xì)胞分化的能力，該過(guò)程主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)、p53、p38 MAPK、APE/REF-1等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。人們通過(guò)大量的研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理可以減少氧化應(yīng)激對(duì)骨髓MSCs的損傷，這對(duì)進(jìn)一步探索氧化應(yīng)激對(duì)骨髓MSCs的損傷機(jī)制意義重大。

氧化應(yīng)激引起骨髓MSCs的衰老和凋亡及相關(guān)機(jī)制MSCs的衰老及凋亡會(huì)損傷組織和器官的修復(fù)能力，這是干細(xì)胞應(yīng)用于治療中的一個(gè)重大問(wèn)題。與胚胎干細(xì)胞不同，骨髓MSCs不具有無(wú)限自我更新的能力，它們復(fù)制的能力逐漸退化，最終會(huì)衰老死亡，這也被稱為復(fù)制性衰老［9］。而氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ROS大量聚集可使骨髓MSCs出現(xiàn)應(yīng)激誘導(dǎo)的早熟性衰老 (stress-induced premature senescence，SIPS)，SIPS和復(fù)制性衰老都具有相似的形態(tài)學(xué)特征、β-半乳糖激酶活性及細(xì)胞周期停滯的特點(diǎn)［10］。細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS還可通過(guò)p53途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)抗氧化劑調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的ROS水平可以維持骨髓MSCs的特性，增加其存活，這更加證實(shí)了ROS對(duì)MSCs的作用。

眾多研究表明，ROS可通過(guò)多種途徑參與骨髓MSCs的衰老及凋亡，其中主要包括 AKT、p53、p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase，JNK)等信號(hào)分子。

PI3K/AKT是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下存活的重要信號(hào)途徑，它參與了體內(nèi)許多生理機(jī)制的調(diào)控，如新陳代謝、細(xì)胞周期，以及細(xì)胞的遷移和生存。AKT信號(hào)途徑磷酸化后可以激活B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗凋亡蛋白，它還能使 Bad、caspase-9和FH轉(zhuǎn)錄因子等凋亡因子失活，增加細(xì)胞的抗凋亡能力［11］。在給予AKT抑制劑阻礙AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路后，它在氧化應(yīng)激條件下保護(hù)細(xì)胞生存的能力明顯下降，這更加肯定了AKT對(duì)骨髓MSCs的保護(hù)作用。AKT的磷酸化同時(shí)能通過(guò)增加p38β的活性來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制凋亡分子JNK［2］。不僅如此，有報(bào)道稱AKT信號(hào)途徑的磷酸化還和MSCs的分化相關(guān)［12］。

p53/p21Cip1在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、衰老、分化等多種生物過(guò)程中起重要作用。過(guò)度的氧化應(yīng)激會(huì)使細(xì)胞內(nèi)聚集大量的ROS，這些活性氧簇會(huì)通過(guò)p53作用其下游靶點(diǎn)p21Cip1來(lái)抑制CDK/cyclin復(fù)合體的活性并下調(diào)pRb/E2F軸，最終降低MSCs的自我更新及再生能力，促使其衰老［13-15］。p53/p21途徑還可通過(guò)和p16/pRb途徑相互作用共同誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)SIPS［14］。相反，有研究表明p53能感受細(xì)胞內(nèi)的ROS，具有抗凋亡活性［16］。p53轉(zhuǎn)錄因子還參與了骨髓MSCs的凋亡，它不僅可以上調(diào)Bax、Bak等促凋亡因子，還通過(guò)下調(diào)Bcl-2、Bcl-x等抗凋亡因子來(lái)影響 MSCs的存活［13］。

另外，還有研究證實(shí):p38 MAPK途徑的激活參與調(diào)節(jié)骨髓MSCs細(xì)胞的早期凋亡，JNK信號(hào)途徑則調(diào)節(jié)骨髓MSCs細(xì)胞的晚期凋亡［17］。ROS通過(guò)線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激靶向p38 MAPK途徑，p38 MAPK通過(guò)調(diào)節(jié)Bax的轉(zhuǎn)移和細(xì)胞色素C的釋放誘導(dǎo)骨髓MSCs的凋亡。增加的ROS還會(huì)激活氧化敏感型JNK信號(hào)通路，JNK發(fā)生磷酸化后會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體內(nèi)，使線粒體發(fā)生去極化而降低線粒體的膜電位、釋放線粒體中的細(xì)胞色素c入胞漿。Bax發(fā)生寡聚化并轉(zhuǎn)移到線粒體膜上加速了細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)一步激活caspase-3，形成依賴caspase的凋亡途徑，最終誘導(dǎo)骨髓MSCs的凋亡［17］。

氧化應(yīng)激抑制骨髓MSCs的增殖和分化及相關(guān)機(jī)制在氧化應(yīng)激條件下，ROS介導(dǎo)了有關(guān)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)信號(hào)途徑，還有一些間接證據(jù)表明，給予細(xì)胞抗氧化劑治療后可以降低ROS對(duì)骨髓MSCs增殖及分化的影響［18］。在MSCs向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，抗氧化酶的合成會(huì)上調(diào)，繼而ROS的生成會(huì)減少，這提示較低濃度的ROS更有利于骨髓MSCs向成骨細(xì)胞分化。體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)外源性過(guò)氧化氫可以阻礙MSCs向成骨細(xì)胞分化，因此ROS的聚集可阻礙 MSCs的分化［19］。

雖然已經(jīng)有報(bào)道指明ROS可影響MSCs的增殖及分化，但其作用途徑尚未明確，仍需要大量研究進(jìn)一步探索。新近研究發(fā)現(xiàn)，APE/REF-1及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶 (extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號(hào)分子涉及該過(guò)程。

APE/REF-1酶是修復(fù)氧化性損傷的限速酶，ROS對(duì)機(jī)體造成的損傷可以誘導(dǎo)該酶生成。APE/REF-1信號(hào)途徑可以阻礙細(xì)胞內(nèi)ROS的聚集，進(jìn)而調(diào)控MSCs的分化［20］。APE/REF-1通過(guò)抑制 NADPH氧化酶來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)的ROS，激活型的APE/REF-1能和一些氧化應(yīng)激調(diào)控轉(zhuǎn)錄分子如缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factors，HIF-1)、p53、活化蛋白-1結(jié)合，這些轉(zhuǎn)錄分子會(huì)改變應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，該信號(hào)途徑也可通過(guò)和p53的交互作用調(diào)控MSCs的衰老。氧化型APE/REF-1能促進(jìn)p53與DNA結(jié)合的同時(shí)，p53也對(duì)APE/REF-1起著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。在內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高會(huì)誘導(dǎo)APE1/REF-1的表達(dá)。然而，Heo等［20］在體外建立了MSCs的氧化應(yīng)激模型，他們發(fā)現(xiàn)在給予H2O2處理48 h后，MSCs內(nèi)表達(dá)的APE1/REF-1在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都出現(xiàn)下降。這種現(xiàn)象可能是因?yàn)镽OS過(guò)度的聚集破壞了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力，激活的p53使APE1/REF-1的表達(dá)下降，進(jìn)一步加重了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的MSCs的衰老。

ERK信號(hào)通路與MSCs的增殖和分化有關(guān)，它屬于MAPK家族。MAPK的激活可以誘導(dǎo)間充質(zhì)向成骨細(xì)胞分化，抑制其向脂肪細(xì)胞分化。MAPK途徑可激活并磷酸化核結(jié)合因子α1(core binding factor α1，cbfα1)，cbfα1可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞特異 Ocn基因的轉(zhuǎn)錄和骨髓細(xì)胞外基質(zhì)的合成，該基因缺失的純合子小鼠成骨細(xì)胞功能會(huì)喪失［21］。持續(xù)的ERK2激活可促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞的分化，另外它還參與了骨橋蛋白的表達(dá)、基質(zhì)的沉積和礦化。關(guān)于ERK1/2對(duì)MSCs增殖的作用眾說(shuō)紛紜:有部分學(xué)者認(rèn)為，ERK1/2途徑介導(dǎo)了肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)MSCs有絲分裂的抑制，從而阻礙了細(xì)胞的增殖;相反，還有大量證據(jù)證明ERK1/2途徑能促進(jìn)MSCs的增殖，用表皮生長(zhǎng)因子處理的人骨髓MSCs表現(xiàn)出明顯的增殖活性，實(shí)驗(yàn)證明這和ERK的表達(dá)呈正相關(guān)［22-23］。研究表明，抗氧化劑白藜蘆醇可通過(guò)ERK途徑提高骨髓MSCs的增殖能力并誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化，且應(yīng)用ERK特異性抑制劑PD98059后，抗氧化劑的作用明顯被抑制［18］。由此可見(jiàn)，ROS很有可能通過(guò)該途徑影響骨髓MSCs的增殖與分化。

有趣的是，衰老相關(guān)的信號(hào)途徑也同時(shí)介導(dǎo)著骨髓MSCs的分化，研究證明PI3K也是MSCs分化的關(guān)鍵點(diǎn)，隨后對(duì)大量衰老相關(guān)蛋白的檢測(cè)更加證實(shí)了這點(diǎn)［24］。這提示要將MSCs的多種生物學(xué)行為聯(lián)系起來(lái)才能認(rèn)清其作用機(jī)制。

抗氧化應(yīng)激預(yù)處理可增強(qiáng)骨髓MSCs的功能氧化應(yīng)激對(duì)骨髓MSCs的作用嚴(yán)重影響其存活，增加其抗氧化應(yīng)激能力成為提高M(jìn)SCs移植效果的突破點(diǎn)。最近，越來(lái)越多的報(bào)道表明，用趨化因子、生長(zhǎng)因子、藥物、缺氧等因素預(yù)處理可以明顯改善MSCs的存活能力，預(yù)處理的細(xì)胞能減少ROS對(duì)細(xì)胞活性、細(xì)胞膜以及氧代謝的損害，并增加HIF-1α、生存素、磷酸化的AKT以及Bcl-2基因和蛋白水平的表達(dá)［25-27］。

越來(lái)越多的研究證實(shí)對(duì)骨髓MSCs進(jìn)行抗氧化劑及其他藥物預(yù)處理可增強(qiáng)MSCs的抗氧化應(yīng)激能力［25-26］。有研究表明，用擴(kuò)血管藥物二氮嗪預(yù)處理可通過(guò)核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號(hào)傳導(dǎo)通路在預(yù)處理晚期保護(hù)骨髓MSCs免受氧化應(yīng)激損傷。眾所周知，ROS可以通過(guò)激活NF-κB途徑發(fā)揮氧化應(yīng)激反應(yīng)，而多項(xiàng)研究表明激活的NF-κB可能和細(xì)胞發(fā)生癌變有關(guān)，所以對(duì)該途徑的精確調(diào)控是細(xì)胞凋亡和癌變的關(guān)鍵［26］。另外，一些抗氧化劑還可以通過(guò)抑制JNK的磷酸化來(lái)降低氧化應(yīng)激對(duì)骨髓 MSCs的損傷［2］。

基于對(duì)組織進(jìn)行缺血預(yù)處理可以保護(hù)缺血組織的損傷，人們提出了對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行缺氧預(yù)處理可以改善氧化應(yīng)激下干細(xì)胞的存活。長(zhǎng)期的缺氧可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶途徑激活，增加了ROS的產(chǎn)生，而且還能通過(guò)減少過(guò)氧化氫酶的表達(dá)來(lái)減少ROS的降解，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。然而，缺氧預(yù)處理可以減少缺氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞造成的損傷，它不僅能通過(guò)增加AKT、Bcl-2等“存活基因”的表達(dá)來(lái)增加骨髓MSCs的存活，而且可以增加SOD等抗氧化酶水平來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。同時(shí)，缺氧預(yù)處理還能恢復(fù)因缺氧造成的細(xì)胞流動(dòng)性的改變［27］。

需要指出的是，氧化應(yīng)激通過(guò)這些不同信號(hào)通路作用于骨髓MSCs所產(chǎn)生的作用是一個(gè)多因素綜合的結(jié)果，信號(hào)之間會(huì)相互影響交織成一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)從而維持骨髓MSCs的正常功能，所以就會(huì)出現(xiàn)不同研究對(duì)同一信號(hào)通路相關(guān)激酶的激活和抑制都會(huì)對(duì)骨髓MSCs產(chǎn)生相同的作用。因此，需要對(duì)多種信號(hào)通路綜合分析才能更清楚地認(rèn)識(shí)到氧化應(yīng)激對(duì)骨髓MSCs作用的結(jié)果。

結(jié) 語(yǔ)

氧化應(yīng)激可通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)影響骨髓MSCs的存活、衰老及增殖分化，各種干預(yù)措施可以通過(guò)改變ROS的代謝及作用于相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)骨髓MSCs的生物學(xué)行為。ROS對(duì)骨髓MSCs的作用也啟示可以通過(guò)ROS介導(dǎo)的信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控白血病干細(xì)胞的分化、凋亡及衰老，這對(duì)治療惡性血液系統(tǒng)疾病具有深遠(yuǎn)的意義。氧化應(yīng)激對(duì)MSCs的影響不僅為干預(yù)造血性疾病找到了新的靶點(diǎn)，而且為MSCs的體外擴(kuò)增及修復(fù)受損組織提供了有力保障，使MSCs能廣泛地應(yīng)用于消化、循環(huán)、神經(jīng)、免疫等多種系統(tǒng)疾病的治療中。

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