李曉娟，白云峰，崔 智，高 蓉，鮑龍濤，李瑞生

(1.解放軍第302醫(yī)院實驗技術(shù)研究保障中心，北京 100039；2.解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京 100853)

我國是肝癌(HCC)發(fā)病率較高的國家之一，近20年來肝癌的病死率呈上升趨勢，已成為我國第2位惡性腫瘤［1］，也是世界范圍內(nèi)死亡率最高的惡性腫瘤之一。肝癌是由病毒、化學(xué)致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相關(guān)基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新復(fù)活等諸多因素引起肝細(xì)胞生長失控而致癌變，經(jīng)啟動、促進(jìn)和演變等多階段的發(fā)病過程，并與基因調(diào)控和表達(dá)密切相關(guān)［2］，由此可見肝癌的發(fā)生發(fā)展過程是多因素作用的結(jié)果，目前肝癌的致病機(jī)理尚未研究清楚，尚未尋找到有效的治療方法，因此深入闡明肝癌的致病機(jī)理對于研發(fā)新的藥物治療靶位和解決臨床治療難點(diǎn)具有十分重要的意義。大量的研究者應(yīng)用常用的實驗動物如小鼠、大鼠、裸鼠、倉鼠、家兔、土撥鼠和豬等建立了許多優(yōu)質(zhì)的肝癌動物模型，這些模型的建立采用的方法各不相同，常見的有自發(fā)性肝癌模型、誘發(fā)性肝癌模型、移植性肝癌模型和轉(zhuǎn)基因肝癌模型等。這些動物模型從不同的角度揭示了肝癌的發(fā)病原因和致病機(jī)理，也為今后尋求有效診斷方法，提高人類肝癌的診治率提供了理論參考。下面就針對這些動物模型的研究進(jìn)展情況進(jìn)行探討和綜述。

1 小鼠

應(yīng)用小鼠來復(fù)制動物模型是最經(jīng)濟(jì)最理想的，目前小鼠肝癌動物模型主要包括化學(xué)誘導(dǎo)性、移植性、轉(zhuǎn)基因和裸小鼠肝癌動物模型?；瘜W(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌模型的特點(diǎn)是其發(fā)生過程類似于人肝癌發(fā)生的“損傷-纖維化-惡性轉(zhuǎn)化”周期變化，誘導(dǎo)劑包括：二乙基亞硝胺(DEN)、過氧化物酶體激增劑、四氯化碳、黃曲霉素(AFB)和硫代乙酰胺等，常規(guī)的誘導(dǎo)方法通常是將其中一種或幾種組合作用于小鼠建模，新生小鼠對AFB極敏感，而成年小鼠有一定耐受性［3］，通常誘導(dǎo)建模周期為4～6個月甚至一年。劉勇等［4］使用 DEN、部分肝切除(PH)和二乙?；?2-AAF)復(fù)合法建立小鼠原發(fā)性短期誘導(dǎo)模型，不僅能夠節(jié)約大量的人力物力時間，而且實驗效果很好。

移植性小鼠肝癌模型的優(yōu)點(diǎn)是飼養(yǎng)方便，操作簡單，此模型適用于藥物篩選及較大規(guī)模的實驗性治療。目前常用的移植腫瘤包括H615肝癌(615系小鼠同基因型瘤株)和H22腫瘤株。H615肝癌模型是將H615肝癌瘤株植入615近交系小鼠腫瘤皮下、肌肉或腹腔內(nèi)，此模型對化療藥物的敏感性與肝癌的臨床化療效果相近，可用作肝癌的基礎(chǔ)研究及藥效學(xué)研究以及不同治療方案的比較與探索［5］。H22腫瘤株屬于小鼠的肝細(xì)胞瘤(保持了上皮來源腫瘤的基本特征)，是將OAAT涂于C3H小鼠的皮膚100次后誘發(fā)，皮下傳代的肝臟實體瘤。此模型可廣泛應(yīng)用于腫瘤基礎(chǔ)研究及藥物篩選，并且成為了公認(rèn)的中醫(yī)藥研究抗腫瘤作用及機(jī)制的良好腫瘤模型［6］。

而目前最新應(yīng)用的是轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型，由于轉(zhuǎn)基因動物模型可按照研究需要進(jìn)行設(shè)計和培育，其建立過程的本身就可進(jìn)行疾病機(jī)制的研究，同時轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)育過程是一個立體的實驗體系，不但能從動物整體的組織器官水平上進(jìn)行研究，還可以深入到細(xì)胞水平和分子水平，為肝癌發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和臨床醫(yī)學(xué)研究提供了理想的實驗體系。轉(zhuǎn)基因動物模型的實驗動物多選用CD1、C57BL/6×DBA、C57BL/6×SJL等品系小鼠，單基因和雙基因均可作為轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)的外源性基因，單基因如 HBx轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型［7］、SV40轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型［8］；雙基因如 TGFα與 c-myc雙轉(zhuǎn)入的轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型［9］。轉(zhuǎn)入單基因建立的肝癌動物模型比轉(zhuǎn)入雙基因建立的動物模型成功率高，方法步驟簡單，但轉(zhuǎn)入雙基因建立的動物模型所需時間明顯縮短，有利于實驗研究。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立肝癌動物模型為肝腫瘤的病因?qū)W研究開辟了一條新的研究領(lǐng)域。但轉(zhuǎn)基因肝癌動物模型也有制備的技術(shù)難度比較高，操作程序復(fù)雜，成本較高等不足之處。

裸小鼠肝癌動物模型是將人肝癌細(xì)胞株或肝癌組織塊直接移植到裸小鼠體內(nèi)而建立的模型，屬于人鼠異種移植，也是最接近人的一種肝癌模型復(fù)制方法，移植部位根據(jù)實驗?zāi)康暮蛯嶒灄l件的不同可采用腹腔移植、皮下移植和肝內(nèi)移植。移植方法有組織塊移植法、懸液移植法、組織勻漿移植法等。現(xiàn)已建立了5株裸小鼠人肝癌組織模型LTNM 1～5和1株裸小鼠人肝癌細(xì)胞株模型LCNM1，均保留了原發(fā)性人肝癌形態(tài)及功能(分泌人甲胎蛋白)的特征。但大部分人裸小鼠異種移植性肝癌模型轉(zhuǎn)移率較低，孫昉憲等［10］經(jīng)篩選建立的裸小鼠人肝癌高轉(zhuǎn)移模型LCI-D20是目前研究人肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)理及抗轉(zhuǎn)移治療較為理想的高轉(zhuǎn)移模型，被廣泛用于人肝癌的基礎(chǔ)治療研究。

2 大鼠

大鼠由于其體型大于小鼠，便于操作，是復(fù)制肝癌動物模型最常用的實驗動物。目前主要以移植性和誘發(fā)性大鼠肝癌動物模型為主，而裸大鼠人肝癌模型仍在不斷探索研究中。

移植性大鼠肝癌模型具有動物飼養(yǎng)簡單、移植方法簡便、移植成功率高、腫瘤生長快、患鼠生存期短、腫瘤生物學(xué)特性穩(wěn)定而均一(均為肝細(xì)胞癌及高濃度甲胎蛋白分泌)等優(yōu)點(diǎn)［11］。種鼠主要以BERH-2移植性大鼠和Walker-256鼠肝癌肉瘤帶瘤大鼠為主。BERH-2移植成功率較高，適于肝癌的局部治療研究。而 Walker-256瘤株來源于大鼠自發(fā)性乳腺癌，具有部分肉瘤性質(zhì)，能較好地模擬人肝癌的膨脹性和浸潤性生長方式。實驗動物多選用雄性W istar大鼠，該模型性質(zhì)穩(wěn)定、制作方法簡單，成功率高、周期短，自然生存時間為3～4周，已廣泛地應(yīng)用于肝癌影像學(xué)診斷實驗及肝癌局部治療。

根據(jù)移植部位的不同分為：腹腔移植、皮下移植和肝內(nèi)移植。①腹腔移植接種的肝癌主要生長在肝與胃之間呈巨塊狀，有時在肝臟表面及腸系膜處和膀胱附近有一連串小珠狀的半透明腫瘤結(jié)節(jié)，晚期可出現(xiàn)癌性腹水。其優(yōu)點(diǎn)是移植成功率高，罕見自發(fā)消退，生存期短，缺點(diǎn)是腫瘤較深，位置不局限，形態(tài)不規(guī)則而不易觀察及測量。②皮下移植常因腫瘤淺在，局限，便于觀測而被采用。但最大的缺點(diǎn)是有較高的自發(fā)消退率。此種模型一般用于研究腫瘤自發(fā)消退機(jī)理。③肝內(nèi)移植接種的腫瘤位于肝臟內(nèi)部，呈圓形或橢圓形，膨脹性和浸潤性生長，腹水發(fā)生率高。其優(yōu)點(diǎn)是腫瘤在肝臟中生長，與臨床肝癌病例基本相似，且實驗周期短，模型易于建立，是研究肝癌局部治療的良好模型［12］。

而誘發(fā)性大鼠肝癌模型是指用化學(xué)、物理或生物的致癌因素作用于動物而形成的肝癌。其中化學(xué)藥物誘導(dǎo)法最常用，常用的化學(xué)藥物有二乙基亞硝胺(DEN)、黃曲霉素 B1(AFB1)、二甲基偶氮苯(DAB)、乙酰氨基芴(AAF)等，其中 DEN和 AFB1更為常用［13］，常用的實驗動物為 W istar、SD大鼠?；瘜W(xué)致癌物質(zhì)誘發(fā)的肝癌模型操作簡單，是目前應(yīng)用較廣泛的一種方法。其特點(diǎn)是接近于人類肝癌的發(fā)病特點(diǎn)和過程、起病隱匿、病程長，誘癌成功率較高，腫瘤多為彌漫結(jié)節(jié)型。但其誘導(dǎo)時間長，動物死亡率相對較高，且肝癌出現(xiàn)的時間、部位、病灶數(shù)等存在個體差異。由于此類模型誘發(fā)因素和條件可人為控制，因此多用于肝癌病因?qū)W、發(fā)生學(xué)、發(fā)病機(jī)制、遺傳及生物學(xué)特性的研究。①二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)大鼠肝癌模型的特點(diǎn)是誘癌成功率高，主要以肝細(xì)胞癌為主。常用3-4月齡、體重小于250g的大鼠較容易誘發(fā)肝癌。Nakatani等［14］認(rèn)為雄性比雌性形成癌前增生性結(jié)節(jié)的數(shù)目多，摘除睪丸的大鼠可明顯減少肝癌的發(fā)生。②黃曲霉素B1(AFB1)誘發(fā)大鼠肝癌模型誘癌周期常需要一年以上，目前多選用較大劑量AFB1誘癌，Guyonnet等［15］建立了單劑量 AFB1致大鼠肝癌的短期實驗?zāi)Ｐ?，給藥途徑一般用AFB1添加在飼料中食用，也可以腹腔注射給藥，一般不用灌胃給藥。③二甲基氨基偶氮苯(DAB)誘發(fā)大鼠肝癌模型使用含有0.06% DAB的飼料喂大鼠，同時控制飼料中維生素 B2含量(不超過1.5～2mg/kg)，經(jīng)4～6個月可誘發(fā)成功［16］。④乙酰氨基芴(AAF)誘發(fā)大鼠肝癌模型主要給成年大鼠含0.03%2AAF標(biāo)準(zhǔn)飼料，按2～3mg/d/只標(biāo)準(zhǔn)給予 2AAF，經(jīng) 3～4個月可誘發(fā)成功［17］。

裸大鼠人肝癌模型同裸小鼠人肝癌模型相同，均為人鼠異種移植，也是最接近人的一種肝癌模型復(fù)制方法，但裸大鼠肝癌模型目前的文獻(xiàn)報道較少，沈艷等［18］建立了裸大鼠移植人肝癌模型并且與裸小鼠移植肝癌模型進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，與裸小鼠肝癌模型相比其產(chǎn)瘤量大，供血量多，動物形體大，適于實施一些外科小手術(shù)，主要用于腫瘤生物學(xué)特性、陽性掃描及多種實驗性治療研究，是肝癌模型研究的新成果。

3 倉鼠

倉鼠(敘利亞金色倉鼠)在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)以及免疫學(xué)等方面與人有相似之處，可用于制作人類多種疾病的整體動物模型。因此在大鼠、小鼠、裸鼠的研究基礎(chǔ)上，研究開發(fā)使用此種實驗動物建立肝癌模型，為肝癌的治療研究又提供了一個新的研究平臺。2009年毛庭枝等［19］在白紀(jì)剛等［20］應(yīng)用倉鼠pGHAM-1細(xì)胞株建立倉鼠移植性胰腺癌模型的基礎(chǔ)上，又建立了倉鼠移植性肝癌模型，將pGHAM-1培養(yǎng)后接種于倉鼠皮下，成瘤后再接種于倉鼠肝臟，結(jié)果證實 pGHAM-1種植于肝臟的成瘤率達(dá)100%。此動物模型的優(yōu)點(diǎn)具有原位成瘤率高、復(fù)制方法簡便易行，是研究肝癌發(fā)病機(jī)理的又一良好動物模型。

4 家兔

目前有關(guān)家兔肝癌動物模型的文獻(xiàn)報道較少，主要以鼠類模型居多，但各種鼠類模型也存在著許多不足之處，如不適合于外科手術(shù)操作及介入治療方面的研究。家兔肝癌動物模型目前研究報道較多的主要是兔VX2肝癌模型，兔VX2移植瘤來源于Shope乳頭狀病毒誘導(dǎo)的野兔皮膚鱗狀細(xì)胞癌，經(jīng)數(shù)次傳代后而建立，可被接種至肝、腎、肺等器官制成多種移植瘤動物模型［21］。兔VX2肝癌模型制作按接種所使用的瘤株形態(tài)可分為瘤細(xì)胞懸液接種、瘤塊懸液接種、瘤組織小塊接種［22］。其中瘤組織小塊接種法成功率高，對瘤細(xì)胞消耗小，性質(zhì)穩(wěn)定。韓冰［23］等應(yīng)用改良組織塊接種法將組織塊插入注射針頭中，以細(xì)胞懸液注射法的方式注入肝內(nèi)。而移植方法以肝實質(zhì)接種為主，以往多使用開腹手術(shù)進(jìn)行腫瘤移植，而現(xiàn)多借助在超聲、CT等影像監(jiān)視下經(jīng)皮穿刺進(jìn)行肝實質(zhì)接種，此種方法操作更簡便，成瘤率更高，且未改變腫瘤的生長特性，同時對實驗動物手術(shù)創(chuàng)傷小，動物存活率高。這種模型的制作由于簡便易行，實驗周期短、成功率高、重復(fù)性好、模型性質(zhì)穩(wěn)定、同時具備高血供、易形成肺轉(zhuǎn)移而被廣泛地應(yīng)用于肝癌的診斷及治療方面的研究。但此模型不能很好的模擬人肝癌形成過程和臨床特點(diǎn)，其病理形態(tài)學(xué)也存在許多差異，因此該動物模型的研究和應(yīng)用相對較少。

5 土撥鼠

土撥鼠是對乙型肝炎病毒比較敏感的實驗動物，1978年summers等［24，25］發(fā)現(xiàn)土撥鼠具有很高的慢性肝炎發(fā)生率，其中23%在尸解時發(fā)現(xiàn)有肝細(xì)胞癌，并且分離到一種在基因體構(gòu)造或生物學(xué)特性上與人類乙型肝炎病毒有高度相似性的病原體土撥鼠肝炎病毒(WHV)。土撥鼠感染該病毒后的病程和人類感染乙型肝炎病毒比較相似，會引起慢性肝炎和肝癌，但不同的是不會出現(xiàn)肝硬化現(xiàn)象。攜帶WHV的土撥鼠在3年內(nèi)有近100%的幾率會演變呈肝細(xì)胞癌［26］，因此土撥鼠成為了研究人類乙型肝炎病毒復(fù)制、自然病史、致病機(jī)制及防治方法最好的動物模型之一，也是研究肝癌成因及治療很重要的動物模型［27］。但由于土撥鼠很容易感染乙型肝炎病毒，復(fù)制肝癌的時間需要2～3年，因此土撥鼠更多是應(yīng)用于乙型肝炎病毒的模型建立，而不適合于短期肝癌模型建立的研究。

6 豬

由于大動物肝癌模型病變復(fù)雜，不容易重復(fù)，發(fā)病率低，而不常用于肝癌模型的復(fù)制。但是實驗豬肝與人肝在解剖結(jié)構(gòu)上存在很多相似之處，研究人員采用2-乙酰氨基酸制備豬肝癌模型，小劑量多次給藥即可致癌變。因此，在肝癌病理結(jié)構(gòu)變化的研究過程中也有一定的應(yīng)用前景。目前介入治療、熱療等結(jié)合治療成為肝癌治療的重要手段，可以采用耐熱性好的實驗豬作為實驗動物模型來研究熱療治療的劑量，療程長短以及介入與熱療聯(lián)合治療組合等問題的探索［28］。

7 討論

復(fù)制理想的肝癌動物模型應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①腫瘤的形成過程與人類肝癌的自然發(fā)生過程相似，腫瘤生長在肝上，以單性為主；②肝癌細(xì)胞的病理形態(tài)與人的肝癌細(xì)胞相似；③血清AFP及腫瘤酶學(xué)檢測呈陽性；④動物模型穩(wěn)定、易于復(fù)制、操作簡便、實驗周期短［29］。大量的研究者采用了不同實驗動物種群和不同方法力求建立符合以上標(biāo)準(zhǔn)的肝癌動物模型，雖然這些動物模型具備了一定的優(yōu)越性，但也受到許多限制性因素的制約和其重復(fù)性差等不足之處。如人肝癌裸鼠模型是目前實驗中最能反應(yīng)人類肝癌生物學(xué)特性的“活試管”，但裸小鼠飼養(yǎng)條件要求高，體形小，操作精細(xì)，無菌要求高，不適于作經(jīng)肝動脈插管注射等藥物的靶向性研究。裸大鼠對異種腫瘤易于接受，但飼養(yǎng)較為困難，價格昂貴，至今不能廣泛地被推廣應(yīng)用。

隨著對肝癌治療和基礎(chǔ)研究的日益深入，通過基因打靶技術(shù)結(jié)合體細(xì)胞克隆技術(shù)、核酸干擾技術(shù)等可以將離體培養(yǎng)、基因敲除或基因定點(diǎn)修飾后的動物體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成動物個體，將很好地解決動物轉(zhuǎn)基因效率低和基因表達(dá)方面的問題，這些可能成為肝癌動物模型研究新的發(fā)展方向。2003年Kataoka實驗室采用基因打靶法成功建立了PLCε基因敲除小鼠，研究發(fā)現(xiàn) PLCε是癌基因產(chǎn)物Ras及抑癌基因產(chǎn)物Rap的新效應(yīng)蛋白［30］。Shuzo Ikuta等［31］進(jìn)一步證明了TPA介導(dǎo)PLCε的活化而誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致腫瘤的形成。本課題組擬采用化學(xué)誘癌法在PLCε-/-小鼠體內(nèi)建立肝癌動物模型，對比PLCε-/-小鼠與 PLCε+/+小鼠肝臟的病理學(xué)改變、肝腫瘤及癌旁組織形態(tài)、腫瘤及癌旁細(xì)胞增殖情況及分子標(biāo)記物的改變，分析 ras基因構(gòu)造以及突變情況，以及PLCε在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的致病機(jī)理。因此，利用基因打靶技術(shù)可以建立更加符合人體肝癌多種生物學(xué)特性的動物模型，培育出符合實驗要求、與人類近緣、使其誘癌過程相似于人肝癌的發(fā)生過程，且誘癌率高，實驗重復(fù)性好，便于進(jìn)行藥物干預(yù)和療效分析的新的動物模型，從而建立一種理想的基因敲除小鼠肝癌動物模型來詮釋人類肝癌的發(fā)病原因和致病機(jī)理。

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