劉 焱，譚學新，，，李 波，易 新，矯貞濤，何洋洋

(1.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔解剖生理教研室；2.中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔頜面外科，沈陽110001)

種子細胞、支架材料和細胞-支架復合物的構建與培養(yǎng)是組織工程技術［1］的三大要素［2］。組織工程化涎腺樣結構的修復重建，就是利用這一技術解決目前臨床上治療困難的涎腺分泌障礙性疾病(頭頸腫瘤放療后唾液腺功能喪失、先天性唾液腺缺失、干燥綜合征等)。準確觀測和客觀評估細胞在支架上的黏附、分布和生長狀況至關重要。倒置顯微鏡和SEM在組織工程產物的形態(tài)學觀測中較常用。由于大鼠頜下腺細胞(rat submandibular gland cells，RSMGs)與絲素-殼聚糖(silk fibroin-chitosan，SFCs)復合物標本規(guī)格為5mm x 5mm x 2mm；本實驗還選擇了將標本通過冰凍切片處理后經熒光顯微鏡觀察。另一方面也應用了激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM)技術進行觀察。LSCM是斷層掃描的無損傷性連續(xù)光學切片及三維重建技術［3］，同時具有較高的橫向和縱向的分辨率［4］。通過以上四種顯微技術分別對RSMGs與SFCs體外共培養(yǎng)的形態(tài)學進行了觀測，旨在探索適宜的顯微技術對于觀察評估體外構建組織工程化涎腺樣結構的應用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

實驗用0～8d齡SD大鼠，雌雄不限，體重約8～10g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供(SCXK (遼)2003—0009)。DMEM/F12(Hyclon，USA)，胎牛血清(Hyclon，USA)，胰蛋白酶(Hyclon，USA)，抗細胞角蛋白單克隆抗體(CK8，Sigma，USA)，抗淀粉酶抗體(anti-amylase antibody，Sigma，USA)，羊抗兔IgG(博士德，中國)，DAB呈色試劑盒(博士德，中國)，熒光染料 Hoechst33258(Sigma，USA)，蠶絲(山東農業(yè)大學林學院)，殼聚糖(脫乙酰度 ＞90%，江蘇通興成生物制品廠)，倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，Japan)，JSM-T300型掃描電子顯微鏡(島津公司，日本)，熒光顯微鏡(BX61+DP-71，Olympus，Japan)，激光掃描共聚焦顯微鏡(FV1000S-SIM/IX81，Olympus，Japan)。

1.2 方法

1.2.1 RSMGs體外培養(yǎng)、分離純化及鑒定：取0～8d齡SD大鼠，斷頸法處死、消毒。自大鼠的頸部至胸部“工”字型剪開，完全暴露并完整取出雙側頜下腺。分離頜下腺表面薄膜、血管和纖維結締組織；再將組織剪碎成0.5mm3小塊，并均勻地平鋪于預先血清包被的培養(yǎng)瓶底部。翻轉、倒置培養(yǎng)瓶，在37℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育4h，待組織塊貼壁，加入適量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基正置培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。24h后補加培養(yǎng)基1m L，繼續(xù)培養(yǎng)。4d后首次全量換液，棄去大量懸浮細胞，以后每2～3d換液。待細胞長滿單層后，結合酶消化法、差速貼壁法分離純化RSMGs并傳代培養(yǎng)，取對數成長期的第2代細胞用于實驗［5］。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化。

取第2代 RMSGs，PBS溶液洗 3次，用含0.25%胰蛋白酶，0.01%(w/v)EDTA的溶液消化制成單細胞懸液。制作細胞爬片，使用免疫細胞化學SABC法進行CK8及 amylase染色［6］。其中一抗為抗細胞角蛋白單克隆抗體(CK8)及抗淀粉酶抗體，二抗為山羊抗兔IgG。

1.2.2 絲素-殼聚糖支架的制備與預處理：首先將蠶絲剪碎、脫膠、溶解，獲得絲素溶液。將其過濾后注入透析袋(截流分子量為3500D)中透析，再使用聚乙二醇濃縮備用。同時將殼聚糖溶解于2%的醋酸溶液中，得到殼聚糖溶液備用。然后將制取好的絲素溶液和殼聚糖溶液按照75∶25(v/v)充分混合，置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥過夜，獲得絲素-殼聚糖的海綿狀的凍干支架［7］。使用前放入75%酒精中結合紫外光照射12h滅菌，最后再用無菌PBS溶液調節(jié)pH至7.0，待用。

1.2.3 組織工程化涎腺樣結構的體外構建：在超凈工作臺中將無菌絲素-殼聚糖支架(5×5×2)mm放入24孔板中，加入DMEM/F12基礎培養(yǎng)基浸泡。盡量置換出支架孔隙內的PBS溶液，直到培養(yǎng)液不再變淺為止吸出培養(yǎng)基。將支架置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基孵育12h，第2天倒置顯微鏡下觀察確定無菌后接種細胞。使用0.25%胰蛋白酶消化RMSGs細胞，計數，按1×105個/m L密度［8］均勻接種于絲素-殼聚糖支架上，每塊支架正反面分別接種0.1m L細胞懸液，間隔時間2h。4h后補加培養(yǎng)基，每隔1d換1次液。

1.3 種子細胞-支架材料復合培養(yǎng)形態(tài)學檢測

1.3.1 倒置顯微鏡：將接種了RMSGs的絲素-殼聚糖支架細胞復合物繼續(xù)培養(yǎng)。分別在第3、5、7天直接利用倒置顯微鏡觀察。

1.3.2 掃描電鏡(SEM)：選取部分共培養(yǎng)3、5、7 d的標本以3%戊二醛溶液固定，PBS洗3次，乙醇分級脫水后將樣品浸泡于醋酸異戊酯內。臨界點干燥后，噴金鍍膜，SEM鏡下觀察細胞與支架復合生長的超微結構。

1.3.3 熒光顯微鏡：選取部分共培養(yǎng)3、5、7 d的標本直接粘著在涂有OCT的樣品臺上，于冷凍切片機(箱體溫度在-20℃以下)上制取厚度為6μm的冰凍切片［9］。將冷凍切片室溫放置10m in，待切片回溫并干燥，浸于PBS中10m in洗去OCT。熒光染料Hoechst33258用雙蒸水配制成質量濃度為 10mg/L溶液，滴染組織切片室溫下放置 10min，用PBS溶液浸洗3次每次5min。反應在避光濕盒中進行，反應結束時用抗熒光淬滅劑封片。在熒光顯微鏡下進行圖像采集。

1.3.4 LSCM：最后選部分細胞支架復合物(5×5×2)mm不經切片處理［10］，同熒光顯微鏡觀察所采取的方法染色，經過LSCM層掃描三維重建技術觀察體外構建的組織工程化頜下腺上細胞黏附和生長情況。

2 結果

2.1 RSMGs的生長狀況觀察及鑒定

RSMGs原代培養(yǎng)情況的倒置顯微鏡下觀察可見，24～48h后大部分組織塊貼壁。原代細胞從組織塊邊緣游出，折光性良好；3～7 d后細胞呈現(xiàn)以組織塊為中心的放射狀排列(圖1A)。經分離純化并傳代后，第2代細胞長滿單層后細胞排列整體均勻，主要呈3種形態(tài)，即圓形亮細胞、多角形暗細胞和梭形暗細胞三種形態(tài)，其中多角形細胞數目相對多(圖1B)。CK8免疫細胞化學染色呈陽性(圖1C)，淀粉酶免疫細胞化學染色呈陽性(圖1D)；提示體外培養(yǎng)的頜下腺腺細胞保持了其生物學特性。

2.2 體外構建的組織工程化頜下腺形態(tài)學及細胞生長狀態(tài)的觀察

2.2.1 倒置顯微鏡觀察：RSMGs在絲素-殼聚糖共混膜支架上生長第3天時，可在支架邊緣表層觀察到部分細胞粘附長入支架內，細胞呈圓形邊界較清晰。支架內部微環(huán)境無法準確觀察(圖2A)。第5天時支架表淺層細胞量有所增加，然而細胞在支架內伸展、粘附和生長方式仍不能準確觀察(圖2B)。第7天時與支架材料復合生長的細胞數量增長明顯，且細胞在支架上呈均勻地生長，支架深層復合生長情況尚不易觀察評估(圖2C)。

2.2.2 SEM觀察：RSMGs在絲素-殼聚糖共混膜支架上生長第3天時可觀察到，已有部分細胞表面呈現(xiàn)出微絨毛的超微結構，細胞向支架材料伸出偽足，有扁平生長的趨勢；還有部分細胞表面呈現(xiàn)圓球形，尚未向支架伸出足絲。細胞在支架材料上生長狀態(tài)較好(圖3A)。第5天時細胞表面可見明顯凸起的微絨毛樣改變提示細胞分泌出大量促進粘附的細胞外基質。細胞在支架表面向各個方向伸展，呈現(xiàn)平鋪狀生長，狀態(tài)良好(圖3B)。第7天時材料表面的細胞量明顯增多，而且細胞與細胞間彼此伸出偽足相連，還可見到完全平鋪伸展在支架表面呈片狀的細胞，提示細胞生長狀態(tài)佳(圖3C)。

2.2.3 熒光顯微鏡鏡觀察：在絲素-殼聚糖共混膜支架上生長的RSMGs的細胞核用熒光染料Hoechst33258染色。在460nm激發(fā)光源下采圖顯示，細胞核呈現(xiàn)藍色；但由于支架材料在熒光顯微鏡下受到激發(fā)光源照射也會產生繼發(fā)熒光圖像，為對二者加以區(qū)分，故同一視野下在620nm激發(fā)光源下再次采圖。此時圖象顯示支架材料呈現(xiàn)紅色，并將兩圖用軟件處理合成。合成后圖像中細胞核為藍染，支架材料為藍色與紅色混合色。觀察可見復合培養(yǎng)第3天時，RSMGs細胞核邊界清楚、形態(tài)呈圓形或橢圓形，核仁清晰可見。細胞較均勻的散布生長在支架材料上。第5天時支架表面細胞量明顯增加，生長良好。第7天時大量細胞粘附生長與支架材料表面，分布均勻(圖4)。

2.2.4 LSCM觀察：同熒光顯微鏡所見類似，圖中僅呈現(xiàn)藍染的部分為RSMGs細胞核，呈現(xiàn)藍染混合紅染的部分為支架材料。經過LSCM層掃描三維重建技術后可見，RSMGs在絲素-殼聚糖共混膜支架上生長較好。細胞核的形態(tài)為邊界清楚且較為規(guī)則的圓或橢圓形，核仁明顯。對LSCM層掃描三維重建技術而言，即使較厚的光學切片也可以不行組織切片處理，而且能夠從任意角度觀察標本的三維剖面或整體結構，圖像的反差和分辨率也較高(圖5)(圖1～3見文后彩插4，圖4，5見封三)。

3 討論

臨床上由于各種原因(舍格倫綜合征、干燥綜合征、放射性涎腺炎、藥物過敏或自身免疫性疾病等)引起的涎腺分泌功能的障礙，導致唾液量降低，并產生一系列口腔疾病或不適，嚴重影響患者的生活質量。組織工程化涎腺樣結構［11-12］的構建是指利用組織工程技術，在體外培植具有生物活性，且在結構和功能上與自體涎腺相類似的涎腺細胞［13］和支架材料［14］的復合物；培養(yǎng)一段時間后將復合物植入體內，最終形成預定的涎腺樣組織并發(fā)揮其正常生理功能。這一技術已成為最有希望修復涎腺缺損的策略［15］。絲素蛋白(SF)，是一種纖維狀蛋白質，具有如下的生物學特性：對于氧氣和水具有很高的通透性、低炎癥反應性、蛋白酶的敏感性、良好的生物相容性(支持細胞粘附和生長)和高抗拉強度的靈活性。殼聚糖(Cs)是一種具有類似糖胺結構的結晶多糖；以其良好的傷口愈合的特性、無毒性以及低異物反應性成為了一種理想的天然醫(yī)用高分子材料。綜合以上二者的優(yōu)勢，Gobin AS等將SF與Cs共混，旨在建立一種與自然組織類似的具有較好的組織相容性，生物可降解性和可比的力學性能的支架材料［7］。She Z.等通過傅立葉變換紅外光譜(FTIR)和X-射線衍射曲線證實了SFCs是一種具有均勻多孔結構以及納米尺度兼容性的自然衍生聚合物。通過改變二者共混的比例，SFCs支架的壓縮模量和抗壓強度都是可以控制的。MTT法檢測表明，SFCs支架可以促進肝癌細胞增殖，生物相容性較好［16］。

LSCM是以電信號的形式記錄圖像的，并可以采用各種模擬的和數字的電子技術進行圖像處理［17］；LSCM還可以準確的對細胞或組織厚片進行類似CT斷層掃描的無損傷性連續(xù)光學切片及三維重建處理［3］，而且同時具有較高的橫向和縱向分辨率［4］。目前生物醫(yī)學領域中LSCM已較廣泛用于熒光定量測量、共聚焦圖像分析、三維圖像重建、活細胞動力學參數分析和胞間通訊研究等方面［18-19］，有著廣闊的應用前景。本文應用LSCM對RSMGs與SFCs體外共培養(yǎng)情況進行層掃描三維重建。作為分子影像學的方法之一［20］，LSCM可以獲得立體感較強的高清晰形態(tài)圖像，從三維立體角度了解和認識了細胞支架復合物的內部超顯微結構。

本實驗證明，四種顯微技術均可展示RSMGs與SFCs體外共培養(yǎng)的形態(tài)學特征。倒置顯微鏡操作簡單、快捷、經濟，能迅速觀察到活細胞與支架復合情況，觀察的清晰度略低。SEM可以清晰、直觀地觀察細胞支架復合物的表面超微結構，無法觀察到內部形態(tài)結構。經過組織切片處理后，熒光顯微鏡可以較準確的觀測細胞在支架上的錨定和生長情況。對于厚組織標本，采用LSCM結合三維重建技術，可以不經組織學切片處理，直接獲得清晰、精準的細胞在支架表面及深層生長的超微形態(tài)結構，有著十分廣闊的應用前景。

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