隆 敏，周世文

(第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院1.內分泌科、2.國家藥品臨床研究基地，重慶 400037)

上世紀90年代研究發(fā)現(xiàn)可卡因和安非他明可使大鼠紋狀體中某種特異蛋白mRNA水平明顯增高，此后在腦中找到該蛋白片段，遂將此蛋白命名為可卡因-苯丙胺轉錄調節(jié)肽(cocaine and amphetamine regulated transcript，CART)［1］。既往有關CART的研究主要集中于鎮(zhèn)痛、聲驚嚇反應、藥物依賴、獎賞與強化及對神經(jīng)元的保護作用等，近年研究發(fā)現(xiàn)CART可能參與糖尿病發(fā)生發(fā)展，然而也有學者對此提出了質疑［2-3］。本文就CART與糖尿病關系研究綜述如下:

1 CART的表達與修飾

研究證實CART分布十分廣泛，在中樞，CART分布于下丘腦腹內側核(ventromedial nucleus，VMN)、背內側核(dorsomedialnucleus，DMN)、外側下丘腦(lateral hypothalamus，LH)、弓狀核(arcuate nucleus，ARC)、室旁核(paraventricular nucleus，PVN)等核團神經(jīng)元軸突末端和致密小泡中。在外周，CART分布于腸肌叢神經(jīng)元、胰島生長抑素細胞、胃竇G細胞、交感節(jié)前神經(jīng)纖維等?，F(xiàn)已知CART有兩種長度的前體，分別是長型(129個氨基酸)和短型(116個氨基酸)。大鼠和小鼠體內都有長、短兩型，而人體內只有短型。長型和短型CART前體都有一個長度為27個氨基酸的前導序列，這兩種前體經(jīng)過加工處理分別形成102和89個氨基酸殘基，再經(jīng)轉化酶切割分別產(chǎn)生兩種活性片段，長型CART55-102和 CART62-102分別與短型 CART42-49和 CART49-89相對應［1］。

2 CART與糖尿病

2.1CART基因表達與糖尿病基因測定發(fā)現(xiàn)CART基因與人類肥胖基因共存于染色體5q13-14，這種在染色體上位置的接近，使得CART參與能量調節(jié)提供了可能性?；蚨嚯男匝芯堪l(fā)現(xiàn)肥胖人群CART啟動子的3個SNP位點與血漿LDL-C水平和LDL/HDL相關，男性CART基因3'端的A1475G突變與腰臀圍比之間存在明顯相關性［4］。Giudice等［5］揭示CART基因突變可使得人類發(fā)生2型糖尿病的易感性增強。進一步對CART基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增大，胰腺、十二指腸同源性基因及葡萄糖轉運子2免疫活性下降、β-細胞形態(tài)改變、高糖刺激胰島素分泌功能減弱、葡萄糖耐量減低、基礎胰島素水平較高，但基礎血糖水平無明顯變化，體重明顯增加，提示CART有可能參與胰島素抵抗環(huán)節(jié)，而非直接影響血糖水平［3］。TCF7L2是與2型糖尿病關系十分密切的基因，該基因缺失與2型糖尿病發(fā)病及胰腺功能損傷密切相關，Prokunina等［6］通過對34種人類組織以及80種細胞株分析發(fā)現(xiàn)TCF7L2基因轉錄產(chǎn)物與CART表達位置高度一致，并且該轉錄產(chǎn)物表達僅與CART有關，與同是葡萄糖激活神經(jīng)元表達的前阿黑皮素(proopiomelanocorti，POMC)無關，與葡萄糖抑制神經(jīng)元表達的神經(jīng)肽Y(neuropeptide，NPY)及刺鼠色蛋白相關蛋白也無關。

2.2下丘腦CART與糖尿病早期研究認為CART是一種內源性厭食肽。在禁食動物、肥胖Zucker大鼠及糖尿病ob/ob小鼠弓狀核CART mRNA表達下調，甚至幾乎不表達［7］，腦室或PVN內直接注射CART55-102或CART62-102肽不但可以抑制正常進食及饑餓動物的進食，也可抑制肥胖Zucker大鼠進食及腦室內灌注NPY誘導的進食反應［8-9］，但只影響進食量而不影響進食次數(shù)［10］。Larsen等［11］也發(fā)現(xiàn)連續(xù)注射CART 7 d可以抑制正常SD及肥胖Zucker大鼠攝食，引起體重下降，當停止使用后原有的體重下降可得以恢復。CART的抑制食欲作用依賴于其空間結構，利用大腸埃希菌構制CART重組體，并在腦內慢性表達，發(fā)現(xiàn)空間折疊的CART55-102能明顯減少正常大鼠及飲食誘導肥胖大鼠對能量的攝取，但未折疊片斷沒有抑制食欲的作用［12］。然而，并非所有研究均證實CART具有抑制食欲作用，隨后的體外實驗發(fā)現(xiàn)100 nmol·L-1CART能明顯刺激體外培養(yǎng)的下丘腦組織塊 NPY釋放［13］，而后者具有明顯的促進食欲作用。Smith等［14］將裝載有CART基因的腺病毒定位注射于大鼠PVN，使其在核團內局部過表達，結果發(fā)現(xiàn)無論是普食喂養(yǎng)還是高脂喂養(yǎng)CART過表達的大鼠進食及體重均較對照組增加，尤其是在注射后d 65及d 79。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)高脂喂養(yǎng)兩周可使得大鼠下丘腦CART mRNA表達上調，在DMN或ARC內注射0.2 nmol CART可明顯增加空腹或飽食糖尿病大鼠的進食量，同時也使得下丘腦促進食欲的相關多肽，如NPY及刺鼠色蛋白相關蛋白免疫活性增加［15］。CART對進食調節(jié)研究結果的不一致是否是由于CART神經(jīng)元存在不同類型［16］，或是不同解剖部位受體亞型功能差異，亦或高脂飲食誘導差異性反應值得進一步研究。

2.3胰腺CART與糖尿病免疫組化證實接近53.7%的羊胰內神經(jīng)元存在CART免疫陽性，胰腺外分泌組織、神經(jīng)節(jié)及血管廣泛分布著CART陽性神經(jīng)纖維，在結締組織分布著中等數(shù)量的CART陽性神經(jīng)纖維，而導管系統(tǒng)及胰島CART免疫陽性神經(jīng)纖維分布稀少，未能發(fā)現(xiàn)CART陽性神經(jīng)纖維深入胰島內部［17］。CART陽性神經(jīng)纖維或神經(jīng)元存在不同程度的P物質表達，部分有舒血管腸肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)表達，極少量有 NPY表達，提示CART與其它調節(jié)肽共存，參與激素及酶分泌及胰腺血供的調節(jié)［17］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CART除表達于神經(jīng)細胞外，在胰島組織中也有表達，且隨著胚胎發(fā)育，大鼠幾乎所有類型的胰島內分泌細胞(包括α細胞和β細胞)及小鼠的α細胞均表達CART，并在出生左右達到高峰［18］，發(fā)育期大鼠β細胞和成年大鼠δ細胞亦有CART表達［19］。在人類，CART同樣也表達于胰腺神經(jīng)纖維和胰島細胞瘤，且CART表達水平與胰島腫瘤分化程度相關［18］。Wierup等［2］發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠模型β細胞不僅表達CART，而且cAMP足夠時，CART可調節(jié)胰島素分泌，使得高糖情況下胰島素分泌增加;當cAMP缺乏時，CART對胰島素瘤細胞無明顯作用，但能在一定程度上抑制離體胰島胰島素、胰高血糖素及生長抑素的分泌。該小組還發(fā)現(xiàn)激素誘導的糖尿病大鼠模型CART陽性胰島β細胞免疫活性較對照組增加10倍，自發(fā)性糖尿病Goto-Kakizaki大鼠CART陽性胰島β細胞免疫活性較對照組增加30倍［2］。此外，采用基因敲除技術證實了CART參與葡萄糖誘導胰島素分泌功能及體內葡萄糖代謝的調節(jié)作用［3］。這些研究結果顯示CART在維持胰島正常生理功能及2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

3 CART的作用調控

3.1CART表達的網(wǎng)絡調控雙標免疫組化證實，CART與NPY、前阿片黑素細胞皮質激素(proopiomelanocortin，POMC)、膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)等神經(jīng)遞質共存于某些神經(jīng)元或與相應的免疫活性神經(jīng)元形成聯(lián)系，提示CART可能與其它神經(jīng)肽形成相互交錯的網(wǎng)絡結構［20］，其中CART與 NPY 及瘦素關系最為密切［7，17］。研究發(fā)現(xiàn)，CART在NPY下游目標細胞群表達明顯，然而CART不但可抑制腦室內灌注NPY誘導的進食反應［8］，CART亦能在離體實驗中明顯刺激下丘腦組織塊NPY釋放［13］。CART與瘦素也具有相互調節(jié)作用，腦室內注射0.5 μg CART后120 min血清瘦素濃度明顯升高［21］。而瘦素受體在弓狀核CART神經(jīng)元存在表達，采食大鼠持續(xù)灌注瘦素對下丘腦神經(jīng)肽CART mRNA表達無影響，當動物處于絕食狀態(tài)時腦內瘦素水平下降，導致弓狀核內的CART mRNA表達下降約25%，此時再向腦內灌注瘦素后可明顯抑制CART mRNA表達的下降。此外，CART對垂體前葉內分泌激素調控舉足輕重，腦室內注射CART可明顯增加生長激素、催乳素的釋放，提高外周皮質醇水平［21］。

3.2CART受體及其信號通路采用綠色熒光蛋白標記CART55-102，在HepG2細胞株以及下丘腦分離的細胞中找到了CART特異性結合位點，在大腦切片中，CART結合位點主要表達于下丘腦室旁核區(qū)域的神經(jīng)細胞胞體［22］。為進一步研究CART細胞內信號機制，研究人員試圖通過檢測CART55-102阻斷或改變現(xiàn)已知配體與受體的結合找到CART受體，這些受體包括大量的神經(jīng)肽類受體和其它結合位點，比如表皮生長因子、甲狀腺釋放激素、膽囊收縮素1、γ-氨基丁胺、促腎上腺皮質素釋放因子、NPY等，但事與愿違，這些研究結果提示CART受體是迄今為止尚未得以證實的獨立位點［23］。Yermolaieva等［24］發(fā)現(xiàn) CART55-102可抑制海馬原始神經(jīng)細胞電壓依賴的鈣離子內流信號，這一作用極有可能是通過Gi/Go的G蛋白偶聯(lián)受體，呈劑量及時間依賴性地激活胞外信號調節(jié)激酶(extracelluar signal related kinase，ERK1，2)活性，增加磷酸化 ERK1、ERK2的水平，然而這一細胞信號變化并不是在所有細胞株均得以證實［25］。此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)［7］，向腦室內注射CART可引起某些包含有內源性CART的腦區(qū)c-fos水平升高;在胰腺組織，CART通過cAMP/PKA信號通路使得高糖刺激胰島素分泌增加［2］。分析認為，多項研究顯示CART不同片段有著不同生物學效能，這種效能上的差別可能是由于CART與不同亞型受體結合，激活不同信號轉導機制所致。

4 展望

近20年的研究初步證實CART與糖尿病密切相關，盡管如此，仍有許多問題還有待闡明。比如，(1)CART是否直接參與糖尿病的發(fā)病機制:雖然糖尿病動物模型中樞及胰島細胞CART表達存在變化且基因敲出小鼠存在糖耐量異常，但直接注射CART于腦室或局部核團并未導致血糖及胰島素水平明顯改變且敲除CART基因亦未能影響基礎血糖水平，CART與胰島素抵抗的因果關系如何?(2)CART與其它調節(jié)進食及能量代謝相關肽，如NPY、POMC、神經(jīng)介素U等的網(wǎng)絡關系有待理清［20］。(3)CART在中樞及外周均顯示出多種生物學活性，然而目前對CART受體的研究較為局限，對其受體亞型及受體后信號通路的認識尚無定論，等等?？傊嘘PCART在糖尿病中的作用亟待深入研究，并有望為糖尿病治療提供新的思路。

［1］Dylag T，Kotlinska J，Rafalski P，et al.The activity of CART peptide fragments［J］.Peptides，2006，27(8):1926-33.

［2］Wierup N，Bj?rkqvist M，Kuhar M J，et al.CART regulates islet hormone secretion and is expressed in the beta-cells of type 2 diabetic rats［J］.Diabetes，2006，55(2):305-11.

［3］Wierup N，Richards W G，Bannon A W，et al.CART knock out mice have impaired insulin secretion and glucose intolerance，altered beta cell morphology and increased body weight［J］.Regulatory Peptides，2005，129(1-3):203-11.

［4］Challis B G，Yeo G S，F(xiàn)arooqi I S，et al.The CART gene and human obesity:mutational analysis and population genetics［J］.Diabetes，2000，49(5):872-5.

［5］Del Giudice E M，Santoro N，Cirillo G，et al.Mutational screening of the CART gene in obese children:identifying a mutation(Leu34Phe)associated with reduced resting energy expenditure and cosegregating with obesity phenotype in a large family［J］.Diabetes，2001，50(9):2157-60.

［6］Prokunina-Olsson L，Hall J L.Evidence for neuroendocrine function of a unique splicing form of TCF7L2 in human brain，islets and gut［J］.Diabetologia，2010，53(4):712-6.

［7］Kuhar M J，Adams L D，Hunter R G，et al.CART peptides［J］.Regulatory Peptides，2000，89(1-3):1-6.

［8］Volkoff H，Peter R E.Effects of CART peptides on food consumption，feeding and associated behaviors in the goldfish，Carassius auratus:actions on neuropeptide Y-and orexin A-induced feeding［J］.Brain Res，2000，887(1):125-33.

［9］Yu Y，South T，Wang Q，Huang X F.Differential expression of hypothalamic CART mRNA in response to body weight change following different dietary interventions［J］.Neurochem Int，2008，52(8):1422-30.

［10］Aja S，Robinson B M，Mills K J，et al.Fourth ventricular CART reduces food and water intake and produces a conditioned taste aversion in rats［J］.Behav Neurosci，2002，116(5):918-21.

［11］Larsen P J，Vrang N，Petersen P C，Kristensen P.Chronic intracerebroventricular administration of recombinant CART(42-89)peptide inhibits and causes weight loss in lean and obese Zucker(fa/fa)rats［J］.Obes Res，2000，8(8):590-6.

［12］Couceyro P R，F(xiàn)ritz T.Production of recombinant CART peptides in Escherichia coli with agonist and antagonist effects on food intake in rats［J］.Protein Expr Purif，2003，32(2):185-93.

［13］Stanley S A，Small C J，Murphy K G，et al.Actions of cocaineand amphetamine-regulated transcript(CART)peptide on regulation of appetite and hypothalamo-pituitary axesin vitroandin vivoin male rats［J］.Brain Res，2001，893(1-2):186-94.

［14］Smith K L，Gardiner J V，Ward H L，et al.Overexpression of CART in the PVN increases food intake and weight gain in rats［J］.Obesity，2008，16:2239-44.

［15］Hou J，Zheng D Z，Zhou J Y，et al.Orexigenic effect of cocaine and amphetamine-regulated transcript(CART)after injection into hypothalamic nuclei in streptozotocin-diabetic rats［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010，37(10):989-95.

［16］Abbott C R，Rossi M，Wren A M，et al.Evidence of an orexigenic role for cocaine-and amphetamine-regulated transcript after administration into discrete hypothalamic nuclei［J］.Endocrinology，2001，142:3457-63.

［17］Arciszewski M B，Ca?ka J，Majewski M.Cocaine-and amphetamine-regulated transcript(CART)is expressed in the ovine pancreas［J］.Ann Anat，2008，190(3):292-9.

［18］Wierup N，Sundler F.CART is a novel islet regulatory peptide［J］.Peptides，2006，27(8):2031-36.

［19］Wierup N，Kuhar M J，Nilsson B O，et al.Cocaineandamphetamine-regulated transcript(CART)is expressed in several islet cell types during rat development［J］.J Histochem Cytochem，2004，52:169.

［20］鄭旭煦，歐陽克清，胡應和，等.Neuromedin U及其受體的研究進展［J］.中國藥理學通報，2005，20(4):373-7.

［20］Zheng X X，Uoyang K Q，Hu Y H，et al.Progress on neuromedin Uand its receptors［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，20(4):373-7.

［21］Baranowska B，Wolińska-Witort E，Martyńska L，et al.Effects of cocaine-amphetamine regulated transcript(CART)on hormone release［J］.Regulatory Peptides，2004，122(2):55 – 9.

［22］Keller P A，Compan V，Bockaert J，et al.Characterization and localization ofcocaine and amphetamine regulated transcript(CART)binding sites［J］.Peptides，2006，27(6):1328-34.

［23］Vicentic A，Lakatos A，Jones D.The CART receptors:background and recent advances［J］.Peptides，2006，27(8):1934-7.

［24］Yermolaieva O，Chen J，Couceyro P R，Hoshi T.Cocaine-and amphetamine-regulated transcript peptide modulation of voltage-gated Ca2+signaling in hippocampal neurons［J］.J Neurosci，2001，21:7474-80.

［25］Lakatos A，Prinster S，Vicentic A，et al.Cocaine-and amphetamine-regulated transcript(CART)peptide activates the extracellular signal-regulated kinase(ERK)pathway in AtT20 cells via putative G-protein coupled receptors［J］.Neurosci Lett，2005，384:198-202.