徐 鑫 徐羅康 季愛(ài)芳 趙海坤

（1.江蘇省東臺(tái)市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心，東臺(tái) 224200；2.江蘇省常州市生態(tài)技術(shù)應(yīng)用研究所，常州 213131）

豬圓環(huán)病毒2型是近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，該病與豬的多種疾病綜合征有關(guān)，該病毒主要引起斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，導(dǎo)致豬體免疫抑制，從而繼發(fā)或并發(fā)其他疾病。豬圓環(huán)病毒最早于1991年在加拿大發(fā)現(xiàn)，而后迅速蔓延到世界各地。國(guó)外資料顯示，絕大多數(shù)豬群呈血清學(xué)陽(yáng)性[1]。目前，由圓環(huán)病毒引發(fā)豬的多種綜合征已成為導(dǎo)致養(yǎng)豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失的主要原因之一，是養(yǎng)豬業(yè)面臨的殺手。東臺(tái)地區(qū)自2006年以來(lái)，一直連續(xù)發(fā)生“生豬高熱病”，給東臺(tái)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，疫情嚴(yán)重的鄉(xiāng)鎮(zhèn)豬的存欄量減少了60%以上，不少中小型豬場(chǎng)因此而倒閉[2]。本次流行病學(xué)調(diào)查旨在通過(guò)對(duì)東臺(tái)地區(qū)豬血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，系統(tǒng)分析PCV2在豬群中的感染及流行規(guī)律，為PCV2的防治提供科學(xué)依據(jù)，為制定科學(xué)防控措施提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

6.4 μg/ml重組蛋白抗原；標(biāo)準(zhǔn)小牛血清為杭州四季青生物制品公司產(chǎn)品；羊抗豬IgG酶標(biāo)抗體（HRP）為Rockland公司產(chǎn)品（使用前1∶5000稀釋）；低分子量蛋白標(biāo)樣為Fermentas公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自華美生物工程公司

分析純級(jí)國(guó)產(chǎn)化學(xué)試劑：包被緩沖液（0.05M，Na2CO3/ NaH CO3，pH9.6）、PBS（每1 000 ml去離子水中NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，pH7.4）、PBST（0.01 mol/L，pH7.4，PBS+0.5% Tween-20）、底物溶液（24.3 ml 0.1mol/L檸檬酸、25.7 ml 0.2mol/L 、Na2HPO4、50 mlDDW）、2 mol/L H2SO4；

實(shí)驗(yàn)室保存的PCV2陽(yáng)性血清、PCV2陰性血清。

1.1.2 待檢樣品的來(lái)源與處理

被檢血清樣本采自東臺(tái)市東蹲片、東南片、安梁富片、堤西片、市區(qū)（屠宰場(chǎng)）5個(gè)不同地區(qū)，采集范圍覆蓋全市24個(gè)鎮(zhèn)、區(qū)計(jì)50個(gè)豬場(chǎng)、1個(gè)屠宰場(chǎng)。除經(jīng)產(chǎn)母豬采用耳靜脈采血外，其余豬全部采用前腔靜脈采血法無(wú)菌采血，3～5 ml/頭，以4 000 r/min的速度離心5 min后共獲得血清249份，－20℃保存?zhèn)溆?。采樣豬包括經(jīng)產(chǎn)母豬、屠宰豬、中等大育肥豬、斷奶仔豬及哺乳仔豬，所有采樣豬均為未免疫豬。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)方法

采用已建立的間接 ELISA檢測(cè)法。

1.2.2 試驗(yàn)步驟

在聚苯乙稀微孔酶標(biāo)板上，先用純化好的重組蛋白在最適包被條件下包被酶標(biāo)板，封板膜封板4 ℃過(guò)夜；再在96孔U形底聚丙微量板上用PBS分別將待檢血清作1∶40稀釋；將包被好的酶標(biāo)板傾去孔內(nèi)液體，用PBST（0.01 mol/L，pH7.3，PBS+0.5% Tween-20）洗滌3次，5 min/次，在吸水紙上拍干，加入5%牛血清封閉液，200 μL/孔，37 ℃反應(yīng)3 h；封閉后，與前面一樣進(jìn)行洗滌，分別加入稀釋好的待檢血清100 μL/孔加入酶聯(lián)反應(yīng)板，同時(shí)作PCV2陽(yáng)性血清和陰性血清對(duì)照，37 ℃反應(yīng)2 h；洗滌后，加入1∶5 000稀釋的HRP-羊抗豬IgG二抗，100 μL/孔，在37 ℃反應(yīng)2 h；洗滌后每孔加入新鮮配制的底物溶液100 μL，37 ℃顯色15 min，加2 mol/L H2SO4100 μL終止液終止反應(yīng)，在酶聯(lián)檢測(cè)儀上讀處OD490值，進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清樣品數(shù)量

共獲得249份豬血清，其中經(jīng)產(chǎn)母豬血清28份，屠宰豬血清21份，中豬血清100份，斷奶仔豬血清60份，哺乳仔豬血清40份。

2.2 檢測(cè)結(jié)果

按照研究已建立的間接ELISA檢測(cè)方法及其陰陽(yáng)性臨界值的確定原則，即樣本OD490≥0.4，判定為陽(yáng)性，樣本OD490＜0.4的判定為陰性。通過(guò)對(duì)249份豬血清的檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)PCV2抗體陽(yáng)性血清175份，其中經(jīng)產(chǎn)母豬陽(yáng)性血清26份，屠宰豬陽(yáng)性血清17份，中豬陽(yáng)性血清69份，斷奶仔豬陽(yáng)性血清34份及哺乳仔豬陽(yáng)性血清29份；不同區(qū)域豬血清陽(yáng)性率不相同，東蹲區(qū)80.88%，東南區(qū)70%，安梁富區(qū)65%，堤西區(qū)55%以及市區(qū)80.95%；這次試驗(yàn)所檢測(cè)的豬血清樣品采自于東臺(tái)地區(qū)51個(gè)豬場(chǎng)（其中20個(gè)規(guī)模場(chǎng)、30個(gè)散養(yǎng)場(chǎng)、1個(gè)屠宰場(chǎng)），分布于東臺(tái)5個(gè)區(qū)（東蹲區(qū)、東南區(qū)、安梁富區(qū)、堤西區(qū)、市區(qū)），共有陽(yáng)性豬場(chǎng)51個(gè)，陽(yáng)性豬場(chǎng)率為100%；經(jīng)產(chǎn)母豬抗體陽(yáng)性率92.86%，屠宰豬抗體陽(yáng)性率80.95%，中豬抗體陽(yáng)性率69%，斷奶仔豬抗體陽(yáng)性率56.67%及哺乳仔豬抗體陽(yáng)性率72.5%，總平均陽(yáng)性率為70.28%；不同養(yǎng)殖方式豬血清陽(yáng)性率不同，規(guī)模場(chǎng)73.91%，散養(yǎng)場(chǎng)62.22%。

結(jié)果顯示，不同生長(zhǎng)階段豬群和不同規(guī)模豬群的PCV2抗體均具有一定的差異性，具體分析可見(jiàn)后面討論章節(jié)。

3 討論

用已建立的ELISA方法初步進(jìn)行了送檢血清樣品的檢測(cè)，從檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看，目前我國(guó)的豬群中廣泛存在PCV2的抗體，249份中175份呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)70.28%，這與臨床上PCR檢測(cè)PCV2核酸陽(yáng)性率70.70%具有一定的相關(guān)性。

本試驗(yàn)血清是隨機(jī)采樣的，涉及東臺(tái)不同類型的豬只包含了母豬、大豬、中豬、斷奶仔豬及哺乳仔豬，因而具有一定的代表性。

以上數(shù)據(jù)都充分說(shuō)明：PCV2已在東臺(tái)地區(qū)豬群中普遍存在，并且感染嚴(yán)重。而我們知道東臺(tái)地區(qū)近年飼養(yǎng)的豬多為自繁自養(yǎng)或本地區(qū)種豬場(chǎng)相互引進(jìn)，這說(shuō)明東臺(tái)豬群至少在幾年前就已經(jīng)感染了PCV2，只是未引起注意和重視。不同區(qū)域豬群陽(yáng)性率不同，不同養(yǎng)殖方式豬群陽(yáng)性率不同。說(shuō)明PCV2感染范圍廣之外還具有差異性，這與各地豬場(chǎng)豬群日齡的長(zhǎng)短、飼養(yǎng)管理水平的高低、豬的營(yíng)養(yǎng)狀況、機(jī)體的免疫力有關(guān)外，與豬場(chǎng)所處地理位置、區(qū)域特性、養(yǎng)殖環(huán)境以及交通狀況也有著不容忽視的影響：東南區(qū)域養(yǎng)殖場(chǎng)十分密集，一家緊靠一家，并且這種情況到處可見(jiàn)，同時(shí)東南區(qū)域又與南通地區(qū)的養(yǎng)殖大縣海安接壤，其養(yǎng)殖環(huán)境、疫病狀況就可想而知；東蹲線片區(qū)是著名乳豬生產(chǎn)之鄉(xiāng)，母豬則成為地方特色產(chǎn)業(yè)的根本保證和重要資源，而母豬的免疫向來(lái)一直是防疫的漏洞，也是一直比較令人頭疼的事情，PCV2感染當(dāng)然在所難免，再加上母源抗體的垂直傳播使得哺乳仔豬陽(yáng)性率居高不下；安梁富片區(qū)位于204國(guó)道沿線，運(yùn)輸活畜及畜產(chǎn)品車輛眾多且進(jìn)出頻繁，使得各種動(dòng)物傳染病廣泛交叉?zhèn)鞑コ蔀榭赡?，所以這3個(gè)片區(qū)的豬群PCV2感染陽(yáng)性率相對(duì)偏高也就不難理解了。母豬抗體陽(yáng)性率92.86%，屠宰豬80.95%，中豬69%，斷奶仔豬56.67%中還可以看出PCV2抗體陽(yáng)性率與豬的年齡有一定關(guān)系，是隨著豬年齡增長(zhǎng)而升高的，原因是飼養(yǎng)日齡的增長(zhǎng)而感染的機(jī)率大增。唯一不同的是本試驗(yàn)中哺乳仔豬的抗體陽(yáng)性率卻遠(yuǎn)高于斷奶仔豬，究其原因最大可能是哺乳仔豬樣品血清采自于東蹲片區(qū)以及哺乳仔豬體內(nèi)留有高母源抗體。

本試驗(yàn)中母豬和屠宰豬的陽(yáng)性率最高。提示在生豬飼養(yǎng)、收購(gòu)、運(yùn)輸、屠宰等環(huán)節(jié)均要重視該病防治。任何環(huán)節(jié)都可能成豬場(chǎng)內(nèi)外圓環(huán)病毒的持續(xù)感染，大大增加疫情控制的難度。而且在今后很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)會(huì)影響東臺(tái)地區(qū)的養(yǎng)豬生產(chǎn)，成為養(yǎng)豬發(fā)展的潛在威脅，應(yīng)引起相關(guān)部門領(lǐng)導(dǎo)和養(yǎng)豬業(yè)者的高度重視。

我們要警惕“生豬高熱病”，據(jù)了解有些地區(qū)的疫情形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻，即使在疫情初發(fā)地區(qū)，還有很多豬場(chǎng)不斷暴發(fā)，發(fā)病豬表現(xiàn)出體溫升高、皮膚發(fā)紅，并有呼吸道癥狀以及消化道癥狀，發(fā)病率和死亡率均很高。要充分認(rèn)識(shí)PCV2與“高熱病”的關(guān)聯(lián)性，對(duì)PCV2進(jìn)行了科學(xué)防控。實(shí)踐證明，可以降低生豬死亡率50%～60%。一旦發(fā)生PCV2尚無(wú)有效治療方案?？股刈⑸浜土己玫墓芾?，有助于解決繼發(fā)感染或并發(fā)感染。而本病的疫苗正處于試驗(yàn)階段，控制本病只能采取綜合性防制措施：

（1）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，降低飼養(yǎng)密度，減少應(yīng)激因素。（2）實(shí)行嚴(yán)格的進(jìn)出制度，減少和其他病原的感染。（3）搞好環(huán)境衛(wèi)生消毒。（4）保證豬群的營(yíng)養(yǎng)水平。（5）做好豬瘟、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征和豬喘氣病的疫苗接種工作。（6）做好豬群平時(shí)的藥物預(yù)防，控制細(xì)菌性繼發(fā)感染。（7）各職能管理部門加強(qiáng)生豬收購(gòu)、運(yùn)輸、屠宰管理。