高 志,趙海蘋,羅玉敏,吉訓明
(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院,腦血管病研究室,北京100053)
缺血性腦卒中是一種高發(fā)病率、高致殘率及高致死率的疾病。在腦缺血及腦缺血-再灌注損傷的研究中,最常使用大鼠或者小鼠的可逆性大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。由于小鼠的基因型與人類更相似[1],因此小鼠MCAO模型在研究腦缺血及再灌注損傷病理生理變化及基因表達方面有著更大的優(yōu)勢[2]。腦梗死體積與神經功能缺損的行為學評價是判定腦缺血嚴重程度的重要指標,許多研究報告對大鼠的行為學評價進行了闡述[3,4],而對小鼠的研究較少,其評價指標大多移植于大鼠的評價體系,至今為止,還沒有對這一系列的綜合性評價達成共識,不僅有許多不同的測試在使用,而且所應用測試的數(shù)量和頻率也沒有統(tǒng)一的標準。本文對小鼠腦缺血神經功能損傷評價方法包括感覺功能、運動功能、學習能力以及綜合性評價做一綜述。
小鼠MCAO模型中,感覺功能的缺失是對其神經功能判定的一個可靠的指標[5]。目前最常用的是墻角試驗(corner test),最先由 Schallert等[6]提出,后經Zhang等[7]改良,具體操作是將兩個尺寸為30cm ×20cm ×1cm的紙板呈30°夾角放置,將小鼠置于夾角之間,進入夾角深部,雙側的觸須受到刺激后會站立并轉身面向夾角的開口端。正常小鼠從右面或左面轉身的概率基本相等,而一側腦損傷小鼠會優(yōu)先向腦損傷側轉身。墻角試驗可以準側檢測出感覺功能障礙,甚至90d后的輕度局灶性腦缺血,特別是在紋狀體發(fā)生缺血時。此實驗簡單易行,應用廣泛,但 Li等[8]認為墻角試驗對感覺功能恢復程度的檢測不敏感,可能是因為這項試驗是對感覺和運動功能的綜合評價,需要兩種功能都較好的恢復后才能檢測出來,而且不能準確反映單側肢體的運動功能變化。
粘簽試驗(sticky dot test)又稱感覺不對稱試驗,用來確定皮膚敏感性和感覺功能的整合性。當缺血發(fā)生在大腦皮層的感覺區(qū)、皮質脊髓束和紋狀體時,感覺功能發(fā)生明顯缺失。具體方法是將直徑5mm的圓形背膠標簽貼附在小鼠相對無毛的手腕處,當回到飼養(yǎng)籠時,一個正常的小鼠會用牙齒迅速除掉每個圓形標簽,而發(fā)生腦缺血的小鼠首先除掉附著在正常前肢的標簽,然后是病變的一側,并需要花費更多的時間,缺血性病變導致了感覺功能的不對稱性[9]。此外,時間的延遲還表明運動功能的缺失,嘴和前肢運動障礙導致去除粘性標簽相對困難。后續(xù)的測試可以通過逐步增加患側所粘標簽的大小并減小健側的標簽大小,直到患側肢體所受的的刺激變得比健側的更突出,小鼠就開始首先從患側的肢體消除刺激[10]。該方法主要用于對多種病因導致的前肢感覺、皮質運動區(qū)損傷后的功能評價,與人類頂葉受損后對側肢體的忽視癥狀類似。
圓筒試驗(cylinder test)又稱肢體不對稱使用試驗,最早應用于大鼠的行為學評價[9],Kadam等[11]通過改良用來評估小鼠前肢使用和旋轉的對稱性,當小鼠一側的感覺皮層、皮質脊髓束、紋狀體受到缺血損害時前肢的使用發(fā)生不對稱性,進一步觀察會發(fā)現(xiàn)離散運動障礙和協(xié)調運動也相繼發(fā)生[12]。具體操作是將小鼠放置在一個直徑9cm,高度15cm的透明圓桶內。當小鼠后腿站立時,分別記錄最初左前肢、右前肢及兩側前肢同時碰觸筒壁的次數(shù)。當一側前肢(如右側)碰觸筒壁后,另一側前肢(左側)在右側未移開時也碰觸到了筒壁,記錄一次右側和一次同時碰觸。當兩側前肢交替碰觸筒壁時,記錄為同時碰觸,共進行20次重復試驗。最終得分=(右前肢的運動 -左前肢運動)/(右前肢運動左前肢運動)×100%。得分越高說明兩側肢體的不對稱程度越明顯。這種評分方法即使對于沒有經驗的評價者也有較高的可信度。
運動功能的不協(xié)調性和伴隨出現(xiàn)的的代償反應是人類中風的突出特點。大部分腦缺血的動物模型都會在行走、轉彎和游泳等運動中出現(xiàn)相應的功能障礙。Whishaw等[13]在1986年建立了一種大鼠以前肢通過窄縫抓取食物的評價方法,稱為伸爪試驗(skilled reaching test)。該方法可評價單側肢體的運動功能,區(qū)分肢體損傷與修復的細小差別[14],還可以用來評估感覺運動皮層和皮質脊髓束的功能缺失[15,16],對小鼠同樣適用。伸爪實驗盒用透明玻璃制成,長寬高分別為20cm,6cm和20cm,在盒的前壁正中央開一條寬度為0.5cm狹長的縫隙,縫隙底部前壁的外側有放置食物片的凹槽,迫使小鼠從縫隙處伸出患側前肢抓取食物。正常小鼠可從縫隙處伸出前肢,抓取并吃到凹槽內的食物;而腦缺血后的動物不能完成。伸爪實驗可較穩(wěn)定的反映腦缺血慢性損傷變化,對動物伸爪、抓食及吃食過程可作細致的軌跡分析,進而發(fā)現(xiàn)更多的變化特征[17]。
煙囪試驗(chimney test)最早由 Boissier等提出,后經 Heinecke等[18]改良,具體發(fā)方法是在一根長25cm,直徑30mm的透明玻璃管的20cm處作一個記號,水平放置,將小鼠放置于入口處,當其爬至管底時,將玻璃管垂直放置,使其頭朝下,正常狀態(tài)下小鼠會通過快速反應學會倒著走路,到達標記處所需的時間最長不會超過120s,而發(fā)生腦缺血后所用時間會明顯延長,此實驗常用來測試小鼠的運動協(xié)調性。立柱試驗(vertical pole test)主要對前肢的力量,抓握能力和平衡性進行評估[19]。由 Paylor等[20]提出并改進了評分方法,將一根長15英寸、直徑0.75英寸的木棍用膠帶纏繞,以增加摩擦力,水平放置后將小鼠放在木棍中央,將木棍慢慢抬起直至與地面垂直,記錄小鼠在木棍上的時間,評分標準為:0分,在木棍垂直之前已掉落;1m in,時間<20s;2分,20s<時間<40s之間;3m in,40s<時間<60s;4m in,>60s。Hernandez等[21]提出的前肢踩空試驗(foot-fault test)也可用于前肢運動功能的評價,將小鼠放置在不同尺寸的6邊行的鐵絲網上,小鼠在鐵絲上行走,在此過程中會出現(xiàn)踩空或踩滑現(xiàn)象,記錄前肢總共行走的次數(shù)以及踩空的次數(shù),踩空的次數(shù)越多表明小鼠腦損傷越大。爬板試驗(climbing board test)[22]是將小鼠置于一塊包有銅絲網的有機玻璃平板上,先保持平板在水平位置,后逐漸將平板豎起,至小鼠不能攀爬而從平板上落下,記錄此時平板軸線與水平面之間的角度,即爬板角度,重復三次取平均值。爬板試驗用于評價整體協(xié)調功能,也是一種簡便且可定量的指標,但是,該指標變化的恢復較快,僅能用于3d內的急性功能損傷。
為了提高神經功能行為評價的準確性及可信度,近年來各種發(fā)明及改良的裝置、軟件層出不窮。旋轉加速試驗(accelerated rotarod test)首先用于研究神經系統(tǒng)功能的運作,后來才在腦損傷如腦缺血的研究中廣泛應用[23],主要用來評估腦缺血動物運動的平衡和協(xié)調能力。Ahmad等[24]在研究中將其稱為“旋轉跑步機測試”,動物放置在直徑3cm的圓形轉盤的中央,轉盤與一個可調節(jié)速度的轉軸連接,實驗開始后轉軸在1分鐘內從0加速到24轉,記錄小鼠在圓盤上的時間,最大分值為60,腦缺血的嚴重程度與得分成反比。為了排除試驗中可能出現(xiàn)的偶然情況,每只動物可做3次測試,取平均值作為最終得分。此法操作簡單,可行性大,且靈敏度較高。曠場試驗(open field)需要一曠場實驗敞箱的裝置[25],木質,周壁及底面涂黑,底面由面積相等(10cm×10cm)的方格組成,將小鼠放入曠場正中格,用攝像系統(tǒng)記錄動物5min的行為變化,包括水平運動、垂直運動及糞便粒數(shù),數(shù)據用相應的統(tǒng)計軟件分析。該試驗不僅可以用來評價小鼠的運動功能,也可用糞便粒數(shù)反應動物的焦慮狀態(tài)[26]。懸掛試驗(hanging test)最早開始于大鼠的行為學評價,后經Muhammad等[27]的改進成功應用于小鼠,該試驗[28]是將小鼠尾部1cm處用膠帶粘貼懸掛于墻上,用攝像設備記錄小鼠1m in內在墻上運動情況,輸入計算機保存圖像。用計算機軟件處理平均角、優(yōu)勢角和轉動次數(shù)等參數(shù),并計算出相對轉動值。懸掛試驗可以反映小鼠的偏癱癥狀、運動和平衡能力,與梗死面積有較好的相關性,可客觀的反應腦缺血損傷及神經癥狀[29]。
人類腦卒中的發(fā)生經常伴隨著認知與記憶功能障礙,因此在腦缺血的動物模型中也需要對認知、記憶功能進行檢查。常用的評估方法包括水迷宮和跳臺試驗。水迷宮最初由Morris等[30]提出,最先應用于大鼠的認知功能評價,后來發(fā)現(xiàn)它對小鼠[31]和人類[32]同樣適用。將測試小鼠放置于直徑2m的游泳池中,通過其視覺記憶找到隱藏于水下1cm的平臺,如果找不到,表明其記憶受損,其損傷程度可用找到平臺所需的時間進行量化,平臺的位置也可每天變化。當小鼠的前額葉皮層、紋狀體、小腦受損傷時測試結果明顯,對海馬損傷尤其敏感。水迷宮操作簡單,可信度高,在國內外使用較多。旋臂迷宮試驗(radial arm maze)可用于評估腦缺血動物的學習和記憶功能障礙,同樣對海馬的損傷尤為敏感[33]。其實驗裝置包括一個中央平臺及由平臺向四周突出的八個或十二個徑向臂[34]。試驗開始之前,將食物放置在某一徑向臂的末端,動物需禁食一段時間,以保持一定的覓食動力。試驗將小鼠放置在平臺上,依靠其空間感來尋找食物,完成任務后將其放回平臺中央,依靠記憶功能重新尋找食物,為了增加困難,可將食物放在其他徑向臂的末端,記錄犯錯誤的次數(shù)。實驗結果表明腦缺血小鼠的學習與記憶障礙明顯。
跳臺測試(step-down test)[35]需要用到小鼠跳臺儀,此裝置用黑色有機玻璃分割成5間,箱底放置銅柵,每間右后角置一高3cm,直徑4cm的橡皮墊作為動物逃避電擊的安全區(qū),實驗時小鼠放置在橡皮墊上,通36V交流電,小鼠跳至銅柵上時會受到電擊,正常反應是跳回安全區(qū)以躲避電刺激。時間持續(xù)5min,記錄每只小鼠受到電擊的次數(shù)作為記憶成績。此實驗受人的主觀意識影響較小,能夠客觀的評價小鼠記憶能力。此外,測試小鼠學習記憶能力的方法還有避暗試驗、T形迷宮試驗、穿梭箱試驗和高架十字迷宮試驗等。
國際腦卒中治療臨床前研究指南(STAIR)指出,在腦缺血治療藥物研究中,多重指標綜合評價很重要,各種行為學的結果都應該評價[36]。目前,國內外主要采用 Longa五分法[22]對小鼠進行綜合性評分(以右側腦缺血為例),即0分,無明顯神經功能損害癥狀;1分,左肢體不能完全伸展;2分,行走時向左側旋轉;3分,行走時向右側傾倒;4,不能自發(fā)行走;5分,死亡。另外Bederson等[37]提出的3級評分方法和以后改良的4分和5分法[38]的癥狀評分法也被大多國內外研究者采用,上述兩種評分方法操作簡單,節(jié)約時間,但都存在主觀性較大,結果不夠客觀的缺點,并且評價不夠全面,評分不夠細致。Clark評分[39]分別從局灶性功能損傷和一般功能損傷兩個角度對小鼠的感覺運動功能進行了綜合性評價,總分為28分,它通過對毛發(fā)、耳朵、眼睛、體態(tài)等細微的觀察,以及步態(tài)、攀爬、身體對稱性、自主運動和癲癇發(fā)作的測試進行了評價,并且與腦梗死體積的比例具有良好的的相關性。Garcia JH評分[40]與Clark評分相似,最早應用于大鼠,是對大鼠的運動功能和感覺功能的綜合性評價,經過改良,也可對小鼠進行評價。
綜上所述,缺血性卒中引起的腦損傷通常與運動、感覺和認知功能障礙等相關,實驗研究主要集中于評估與腦缺血動物模型相關的行為和認知上的改變。迄今為止,還沒有一種單一的評價標準被普遍承認,大多數(shù)實驗研究都采用多種不同的評價方法對缺血效果進行綜合評價。神經行為學評價是一門不斷發(fā)展的科學,現(xiàn)有的測試也正在不斷的改進中。上述各項神經功能評分均不同程度地反映了小鼠腦缺血后感覺功能、運動功能和認知功能障礙及后期恢復的程度,可作為造模是否成功的標志。每項評價都具有優(yōu)缺點和側重點,可以根據實驗需要進行選擇或搭配使用,保證實驗的順利進行和結果的可靠性與真實性。
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