張建國，何 婧

己烯雌酚是人工合成的非甾體雌激素物質(zhì)，為無色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末［1］，可用于絕經(jīng)期綜合征、卵巢功能不全引起的各種疾病、前列腺癌及老年性陰道炎等，也可用于前列腺癌［2］。目前，己烯雌酚原料及其制劑的HPLC含量測(cè)定方法在2010版中國藥典都有記載［3］，也有文獻(xiàn)報(bào)道［4-7］。己烯雌酚乳膏是本院臨床長期使用的一種療效優(yōu)良的醫(yī)院制劑，為有效控制本品質(zhì)量，筆者通過實(shí)驗(yàn)建立了操作簡(jiǎn)便、定量準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)的HPLC法用于本品的含量測(cè)定，獲得滿意結(jié)果。

1 儀器與試藥

戴安Ultimate3000型高效液相色譜儀(德國戴安公司);數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司，KQ-100DB);電子分析天平(島津AEU-210型電子天平，d=0.1 mg);己烯雌酚對(duì)照品(中國藥品生物制品鑒定所提供，供含量測(cè)定，批號(hào):000033-200607);己烯雌酚乳膏及空白基質(zhì)(批號(hào):20110226，規(guī)格:5 mg/25 g，均由東風(fēng)公司總醫(yī)院制劑室提供);甲醇(色譜純);乙醇(分析純);水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18(150 mm×2.5 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(70∶30);檢測(cè)波長:254 nm;進(jìn)樣量:20 μL。理論板數(shù)按己烯雌酚峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。己烯雌酚與其他雜質(zhì)峰的分離度:大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取105℃下干燥至恒重的己烯雌酚對(duì)照品12.0 mg，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲混勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(實(shí)配0.127 mg/mL)。

2.2.2 樣品溶液的制備 稱取己烯雌酚乳膏20.0 g(批號(hào):20110226，含量:0.21 mg/g)，精密稱定，置錐形瓶中，加無水乙醇適量，超聲處理30 min，放置至室溫，殘?jiān)脽o水乙醇洗滌2～3次，將溶液全部轉(zhuǎn)入100 mL的量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液，備用。

2.2.3 空白樣品溶液的制備 取己烯雌酚乳膏基質(zhì)按“2.2.2”項(xiàng)下樣品溶液的制備方法制成空白樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 空白干擾實(shí)驗(yàn) 按照上述色譜條件，吸取對(duì)照品溶液、樣品溶液、空白樣品溶液各20 μL分別注入色譜儀，結(jié)果空白樣品溶液中的組分不干擾樣品溶液中己烯雌酚的測(cè)定。己烯雌酚峰的保留時(shí)間為9.1 min。己烯雌酚峰與其他組分的分離度大于1.5，結(jié)果見圖1。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加無水乙醇稀釋成濃度分別為0.012 7、0.038 1、0.063 5、0.088 9、0.114 0 mg/mL的溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以色譜峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得己烯雌酚的回歸方程:Y=982.3X+1.733 4， r=0.999 7(n=5)。顯示己烯雌酚在0.013～0.114 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 己烯雌酚對(duì)照品、樣品及空白樣品色譜圖

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。己烯雌酚峰面積RSD為0.79%(n=5)。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一對(duì)照品溶液，室溫下分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果己烯雌酚峰面積RSD為0.90%，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取己烯雌酚乳膏(批號(hào): 110226)，按“2.2.2”項(xiàng)下平行制備5份樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，依法測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果己烯雌酚的平均含量為0.21 mg/g，RSD為0.99%，結(jié)果顯示重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱取己烯雌酚乳膏10.0 g，精密稱定，取對(duì)照品溶液 (濃度1.03 mg/mL);分別量取1.5、2.0、2.5 mL至樣品中，按“2.2.2”項(xiàng)下樣品溶液的制備方法制成混合溶液，依法進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。分別平行3次，計(jì)算回收率，具體結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定 取3批樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算己烯雌酚乳膏中的己烯雌酚含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長的選擇 本次實(shí)驗(yàn)同時(shí)選擇241、254、260、258、320 nm等6個(gè)波長，結(jié)果顯示，己烯雌酚在254 nm波長時(shí)峰形較好，故選擇該波長。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3.2 流動(dòng)相的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾使用過乙腈-水(用磷酸調(diào)至不同pH值)系統(tǒng)作為流動(dòng)相，在這些系統(tǒng)中己烯雌酚峰形不對(duì)稱，肩峰，拖尾嚴(yán)重，分離度達(dá)不到要求。而采用甲醇-水(70∶30)系統(tǒng)峰形對(duì)稱，肩峰消失，拖尾因子與分離度均達(dá)到要求，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。

3.3 樣品的前處理 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在樣品溶液制備中，當(dāng)加入樣品量過多時(shí)，所得樣品溶液呈糊狀，加入樣品量較少時(shí)，理論塔板數(shù)較低，影響峰形，取己烯雌酚乳膏(批號(hào)為110226)20.0 g所制備的樣品溶液較理想。

3.4 己烯雌酚存在順、反兩種異構(gòu)體，反式體生理活性強(qiáng)，所占比例大，一般制劑多用反式體含量測(cè)定代表己烯雌酚含量。在本次實(shí)驗(yàn)中，順式體出峰很小，可忽略，只在注射液中提到順反勢(shì)存在動(dòng)態(tài)平衡，己烯雌酚順式體換算因子為1.26，且不能忽略順勢(shì)體的含量。

［1］ 黃芬，葉紹輝，龔振明.己烯雌酚的研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2007，34(2):51-54.

［2］ 陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:642.

［3］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(二部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:38-39，153-156，1029-1031.

［4］ 文遠(yuǎn)大，馬柯，趙士冶.高效液相色譜法測(cè)復(fù)方己唑乳膏中己烯雌酚，氯霉素，甲硝唑的含量［J］.中南藥學(xué)，2010，8(11): 832-835.

［5］ 范玉峰，胡守蓮.HPLC法測(cè)定己烯雌酚軟膏中己烯雌酚含量［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2010，12(6):1093-1094.

［6］ 王靜，李軍.HPLC法測(cè)定己烯雌酚軟膏含量［J］.齊魯藥事，2004，23(9):33-34.

［7］ 白林，張艷秀，陸璐.HPLC法測(cè)定己烯雌酚乳膏中己烯雌酚和羥苯乙酯的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(2):168-170.