李娟，趙迪，周悌強(qiáng)，馮素香，李建生

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450008)

補(bǔ)肺益腎顆粒處方是在原補(bǔ)肺益腎處方基礎(chǔ)上精簡(jiǎn)而成［1-2］，由淫羊藿、陳皮、赤芍、黃芪、五味子、山茱萸等十二味中藥組成，現(xiàn)為河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑。該方具有補(bǔ)肺益腎、化痰、活血的功效，是中醫(yī)治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)穩(wěn)定期肺腎氣虛證的有效藥物，可減輕炎癥反應(yīng)和黏液分泌，減少對(duì)氣道壁的損傷，減輕氣道阻塞，從而降低對(duì)肺組織的損傷，延緩肺功能的下降［3-6］。其中淫羊藿為方中君藥，陳皮、赤芍為方中臣藥，原質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)該顆粒劑中淫羊藿苷進(jìn)行測(cè)定，不能全面反映產(chǎn)品質(zhì)量信息。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)對(duì)該顆粒劑中有效成分淫羊藿苷、橙皮苷和芍藥苷進(jìn)行定量分析，為建立簡(jiǎn)便易行的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

1 儀器、試藥

1.1 儀器Waters高效液相色譜儀(2695高效液相泵，2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower 2工作站;美國(guó)waters公司);SHZ—D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);KH—2200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);Sarterius BS 224S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);EYELA N—1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司);HH—6型數(shù)控恒溫水浴鍋(上海比朗儀器有限公司)。

1.2 試藥芍藥苷(批號(hào)0736-200414)、淫羊藿苷(批號(hào)0737-9709)、橙皮苷(批號(hào)0773-9809)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

乙腈(HPLC級(jí)，Grace Company INC)，甲醇(分析純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，磷酸(分析純，天津鷗博凱化工有限公司)，娃哈哈純凈水;補(bǔ)肺益腎顆粒(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科提供)。

赤芍、淫羊藿、陳皮等藥材均購(gòu)自河南鄭州張仲景大藥房，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定分別為毛茛科植物川赤芍Paeonia veitchiiLynch的干燥根、小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornumMaxim.的干燥地上部分、蕓香科植物橘Citrus reticulateBlanco的干燥成熟果皮等。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)(博納艾杰爾科技有限公司)，柱溫:25℃;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脫(A%為19→19→28→28，相應(yīng)時(shí)間周期為0→6→7→20min);體積流量:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含淫羊藿苷0.112mg、橙皮苷0.359 mg、芍藥苷0.258 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備取本品約2 g，研細(xì)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備按處方量并以相同的工藝分別制備不含淫羊藿、陳皮、赤芍的陰性對(duì)照樣品，照上述供試品溶液制備方法處理，得陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照色譜中，在與對(duì)照品及供試品色譜圖對(duì)應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)相應(yīng)色譜峰，表明其它組份對(duì)測(cè)定淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷3個(gè)成分無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品(A)、供試品(B)、缺赤芍陰性樣品(C)、缺陳皮陰性樣品(D)和缺淫羊藿陰性樣品(E)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of m ixed reference substancea(A)，sample(B)，negative sample without Paeoniae Radix rubra(C)，negative sample without Citri reticulatae Pericarpium(D)，negative sample without Epimedii Folium(E)

2.6 線性關(guān)系考察分別精密量取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為對(duì)照品溶液。精密吸取2、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，峰面積和進(jìn)樣量分別取對(duì)數(shù)得Y和X，并以Y對(duì)X進(jìn)行回歸分析，得到淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的回歸方程，見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of linear correlation

結(jié)果表明:淫羊藿苷在0.022 4～0.280 μg，橙皮苷在0.071 8～0.898 μg，芍藥苷在0.051 6～0.645 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)照上述HPLC色譜條件，對(duì)同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積為指標(biāo)考察儀器的精密度，結(jié)果表明，淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷對(duì)照品峰面積的RSD分別為1.2%、1.4%、1.1%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行HPLC測(cè)定，淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷峰面積的RSD分別為0.9%、1.2%、0.8%，表明樣品供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品6份，制備供試品溶液，按上述HPLC色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算，結(jié)果淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.087 6 mg/g、0.367 mg/g、0.243 mg/g，RSD分別為2.17%、2.43%、2.29%，表明重復(fù)性良好。

2.10 耐用性實(shí)驗(yàn)

2.10.1 不同色譜柱精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，選取不同的色譜柱(艾杰爾，V9510525CL0028;依利特，E1517560;Waters，WAT045905)進(jìn)行分離，其它色譜條件不變，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.088 0 mg/g、0.363 mg/g、0.247 mg/g，RSD分別為2.56%、2.31%、2.19%。

2.10.2 不同柱溫精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，注入液相色譜儀，柱溫分別設(shè)定為20℃、25℃、30℃，其它色譜條件不變，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.087 2 mg/g、0.371 mg/g、0.239 mg/g，RSD分別為2.15%、2.48%、2.34%。

2.10.3 不同波長(zhǎng)精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，波長(zhǎng)分別設(shè)定為265 nm、270 nm、275 nm，其它色譜條件不變，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.087 4 mg/g、0.366 mg/g、0.242 mg/g，RSD分別為1.98%、2.23%、2.68%。

以上結(jié)果表明不同色譜柱、不同柱溫、波長(zhǎng)的微小變化對(duì)樣品色譜峰的分離度和含量測(cè)定結(jié)果均未有明顯影響。

2.11 加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含有量(淫羊藿苷0.087 8 mg/g，橙皮苷0.369 mg/g，芍藥苷0.245 mg/g)的補(bǔ)肺益腎顆粒約1 g，共9份，精密稱定，分為3組，每組分別加入質(zhì)量濃度為0.112 mg/mL的淫羊藿苷、0.359 mg/mL的橙皮苷、0.258 mg/mL的芍藥苷對(duì)照品0.8、1.0、1.2 mL，照上述供試品溶液的制備方法及色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的加樣回收率的RSD分別為2.65%、2.12%、2.36%，見(jiàn)表2～4。

表2 淫羊藿苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests of icariin

表3 橙皮苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests of hesperidin

表4 芍藥苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of recovery tests of paeoniflorin

2.12 樣品的測(cè)定取3批補(bǔ)肺益腎顆粒(20110218、20110425、20110603)，照2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，2.1項(xiàng)下HPLC色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3批次樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.5 Determ ination results of three batches of sam ples(n=3)

3 討論

3.1 提取方法的選擇補(bǔ)肺益腎顆粒為中藥復(fù)方制劑，所含成分復(fù)雜多樣。顆粒劑含有量測(cè)定時(shí)供試品溶液制備方法主要有超聲、回流［7-9］。該實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩種提取方法進(jìn)行了比較，超聲提取淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.056 9 mg/g、0.668 mg/g、0.364 mg/g，RSD分別為2.18%、1.27%、1.58%;回流提取淫羊藿苷、橙皮苷、芍藥苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.057 0 mg/g、0.669 mg/g、0.368 mg/g，RSD分別為1.93%、2.16%、2.41%。結(jié)果表明，采用超聲和回流方法提取含有量相近，無(wú)顯著性差異。超聲提取操作簡(jiǎn)便，因此本實(shí)驗(yàn)選擇超聲處理作為供試品溶液的制備方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇該實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定3個(gè)成分，但芍藥苷、淫羊藿苷、橙皮苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為230 nm、270 nm、320 nm［10-13］，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選，分別在200～400 nm范圍內(nèi)不同波長(zhǎng)下測(cè)定混合對(duì)照品，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在270 nm可以同時(shí)兼顧這3個(gè)成分，且呈良好線性關(guān)系，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇在270 nm。

3.3 洗脫梯度的選擇補(bǔ)肺益腎顆粒中含有多種化學(xué)成分，很難找到較為理想的等度洗脫條件。本實(shí)驗(yàn)分別考察了以乙腈-純水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水［14-16］作為流動(dòng)相時(shí)不同濃度和比例的等度以及梯度洗脫的出峰情況，確定了以乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相時(shí)分離度較好。通過(guò)反復(fù)改變乙腈所占比例和變化的時(shí)間，最終確定了該實(shí)驗(yàn)的梯度洗脫程序，在此條件下，供試品溶液中淫羊藿苷、橙皮苷和芍藥苷與相鄰成分分離良好，且陰性溶液無(wú)干擾。

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