藍(lán)海，王毅

(云南省大理學(xué)院藥化學(xué)院，云南大理671000)

齲病，是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病，是人類的常見多發(fā)病之一，世界衛(wèi)生組織將其列為危害人類疾病的第三位，僅次于癌癥和心血管疾?。?］。其所引起的牙體硬組織病理改變涉及牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)。齲病的組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，無論是釉質(zhì)齲、牙本質(zhì)齲或牙骨質(zhì)齲，都是以脫礦為主要過程的病變［2］。20世紀(jì)80年代，再礦化現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)以后，人們逐漸認(rèn)識(shí)到齲病病變是一個(gè)脫礦與再礦化的交替變化的過程［3］。脫礦與再礦化的交替進(jìn)行，可看作是釉質(zhì)中鈣和磷酸鹽移出、移近的動(dòng)力學(xué)過程［4］。

1978 年，Tanizaki發(fā)現(xiàn)鞣酸可抑制牙本質(zhì)膠原的分解阻礙牙本質(zhì)齲的進(jìn)程［5］。紫地榆Geranium strictipesR.Kunth為白族、彝族民間習(xí)用草藥，又名赤地榆、紅地榆、隔山消、萬兩金、地榆［6］。原植物為牻牛兒苗科老鸛草屬植物，入藥為其干燥根［7］，民間長期用作厭食癥的治療，同時(shí)具有消炎、止痢和收斂的功效。研究發(fā)現(xiàn)，紫地榆含有大量的鞣酸，且具有抗酸防齲作用［8］。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)再礦化后的離體牛切牙進(jìn)行顯微硬度測(cè)定，比較天然藥物紫地榆與化學(xué)制劑氟化鈉(NaF)、氯化鑭(LaCl3)對(duì)牙齒再礦化的影響，以期為防齲天然藥物的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑KCl、HAC、NaCl、CaCl2、NaH2PO4、Na2S、Urea、KOH、CH3CH2OH、NaF、LaCl3均為分析純;紫地榆藥材。

1.2 儀器設(shè)備pHS-25C數(shù)字酸度計(jì)(上海鵬順科學(xué)儀器有限公司);E-201-C型pH復(fù)合電極(上海精密科學(xué)儀器有限公司);YMP-2B金相試樣磨拋機(jī)(蘇州歐卡精密光學(xué)儀器有限公司);ZXQ-1全自動(dòng)金相鑲嵌機(jī)(上海緯維電子科技有限公司);402MVD型自動(dòng)轉(zhuǎn)塔數(shù)顯顯微硬度儀(依工測(cè)試測(cè)量儀器上海有限公司);電子天平(波特樂-托利多儀器有限公司);SY5200DH超聲波清洗器(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司);80-2臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司手術(shù)器械廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);303-A-I型電熱恒溫培養(yǎng)箱(蕭山永發(fā)電器有限公司，湖南實(shí)驗(yàn)儀器廠);JC101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海成順儀器儀表有限公司，南通嘉程儀器有限公司)。

1.3 材料處理

1.3.1 標(biāo)本制備市場(chǎng)購買新鮮拔出的牛切牙60顆，去除牙根、軟組織，用去離子水加壓將冠髓沖洗干凈，用YMP-2B金相試樣磨拋機(jī)去除釉質(zhì)表面的色素菌斑，用0.9%的生理鹽水超聲清洗40 min，置于生理鹽水－4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試液提取紫地榆采購于云南大理集盛堂大藥房，經(jīng)大理學(xué)院生藥學(xué)馬曉匡教授鑒定為正品。將紫地榆藥材洗凈置80℃干燥至恒質(zhì)量，粉碎成粉末，準(zhǔn)確稱取20 g于干凈燒杯中，加200 mL無水乙醇超聲提取40 min，離心收集上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成浸膏，把浸膏用200 mL去離子水溶解，即為紫地榆乙醇提取物。

1.4 脫礦脫礦液的制備:0.15 mol/L的KCl，用HAc調(diào)節(jié)pH至4.00。將制備好的牛切牙標(biāo)本浸入100 mL脫礦液中，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置10 d，每5 d更換1次脫礦液。

用ZXQ—1全自動(dòng)金相鑲嵌機(jī)將脫礦后牛切牙的標(biāo)本固定于鑲嵌粉中，露出完好的牙釉質(zhì)。用402MVD型自動(dòng)轉(zhuǎn)塔數(shù)顯顯微硬度儀在正壓力為200 g的條件下測(cè)定上述標(biāo)本硬度，每個(gè)標(biāo)本測(cè)定3次，取其平均值。選取硬度在314 kg/mm2左右的32顆牛切牙標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)樣本。

1.5 再礦化將以上所選32顆牛切牙脫礦牙釉質(zhì)標(biāo)本隨機(jī)分為4組，每組8顆。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，P＞0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中，A組用20 mg/L NaF溶液進(jìn)行再礦化處理，每顆牛切牙標(biāo)本每次用棉簽蘸取20 mg/L NaF溶液涂抹于牙釉質(zhì)1 min，1 d涂抹4次(每隔3h處理1次);其余B，C，D 3組分別用0.5 g/L LaCl3溶液、100 mg/mL紫地榆乙醇提取物、去離子水作再礦化處理，方法同上。每次再礦化處理完畢，各組均再用酸性人工唾液涂抹于牙釉質(zhì)1 min，以模擬口腔再礦化處理程序［9］。

再礦化處理14 d后，用402MVD型自動(dòng)轉(zhuǎn)塔數(shù)顯顯微硬度儀在正壓力為200 g的條件下測(cè)定各組牛切牙標(biāo)本硬度，每個(gè)標(biāo)本測(cè)定3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析對(duì)各組測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

經(jīng)NaF(A組)、LaCl3(B組)、紫地榆乙醇提取物(C組)處理后，各組牙釉質(zhì)表層顯微硬度平均值均明顯高于再礦化前(P＜0.01);去離子水對(duì)照組(D組)牙釉質(zhì)表層顯微硬度平均值與再礦化前相比無明顯變化(P＞0.05)。這一結(jié)果表明NaF、LaCl3、紫地榆乙醇提取物都有促進(jìn)脫礦牛切牙釉質(zhì)再礦化的作用。見表1。

表1 各組再礦化前后牙釉質(zhì)表層顯微硬度平均值(±s，n=3)

表1 各組再礦化前后牙釉質(zhì)表層顯微硬度平均值(±s，n=3)

注:與脫礦后比較，*P＜0.01，＊＊P＞0.05。

組別脫礦后/(kg·mm－2)再脫礦化后/(kg·mm－2)A組314.7±2.0 343.6±2.3*B組313.6±2.2 358.4±3.0*C組314.0±2.7 335.6±2.4*D組313.9±2.9 315.9±2.0＊＊

再礦化后，A，B兩組間牙釉質(zhì)表層顯微硬度平均值比較P＜0.01;A，C兩組間牙釉質(zhì)表層顯微硬度平均值比較P＜0.01;B，C兩組間牙釉質(zhì)表層顯微硬度平均值比較P＜0.01，均有顯著差異。且A，B，C各組牙釉質(zhì)表層顯微硬度平均值與D組比較，都有P＜0.01，也有顯著差異。證明各組數(shù)據(jù)都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

目前，氟化鈉作為主要的防齲藥物，已得到人們的認(rèn)可。其防齲機(jī)制主要包括對(duì)牙的作用和對(duì)細(xì)菌的作用兩大方面。對(duì)牙的作用包括:影響牙形態(tài)，使牙更易自潔而增強(qiáng)抗齲能力;降低釉質(zhì)溶解度促進(jìn)釉質(zhì)再礦化。對(duì)細(xì)菌的作用包括:影響細(xì)菌生長，影響細(xì)菌糖代謝，影響大分子合成。由于氟濃度的穩(wěn)定性，氟化鈉的毒性、亞毒性，以及耐氟菌的出現(xiàn)等問題尚待解決，導(dǎo)致氟化鈉的應(yīng)用受到限制，只能保持在20 mg/L的低濃度安全防齲范圍。

和氟化鈉相比，氯化鑭不僅具備了抑制至齲菌繁殖、黏附、產(chǎn)酸，改變牙菌斑pH值提高牙齒抗酸蝕能力的作用功效［10］;同時(shí)還具有毒性小，不蓄積，使牙釉柱變粗壯，明顯升高牙質(zhì)硬度等優(yōu)點(diǎn)［11］。附著于牙釉質(zhì)表面的La3+可直接取代脫礦過程中釉質(zhì)晶格內(nèi)所離失的Ca2+，以增加牙釉質(zhì)的再礦化程度。但研究表明，氯化鑭的抗酸防齲能力明顯不及氟化鈉，且預(yù)防釉質(zhì)齲需要高于0.5 g/L質(zhì)量濃度的氯化鑭溶液［12］。

紫地榆不同溶劑提取物的抗酸作用不同，乙醇提取物的抗酸作用最強(qiáng)，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)所用紫地榆進(jìn)行乙醇提取。紫地榆含有大量鞣酸，對(duì)氟化鈉與紫地榆抗酸防齲功能進(jìn)行動(dòng)力學(xué)比較可知，100 mg/mL紫地榆水提物抗酸防齲功能明顯強(qiáng)于20 mg/L氟化鈉［13］。早期人工齲的防治主要包括減少酸脫礦和促進(jìn)再礦化兩個(gè)層面。一方面紫地榆中的鞣酸和牙釉質(zhì)中的Ca2+結(jié)合為一種堅(jiān)硬的物質(zhì)——鞣酸鈣沉積在釉質(zhì)表面;另一方面可能是鞣酸與釉質(zhì)中的有機(jī)質(zhì)和鈣結(jié)合形成不溶性的復(fù)合物促進(jìn)再礦化。另外，酸脫礦發(fā)生的釉質(zhì)齲，蛋白不會(huì)丟失，紫地榆可能還會(huì)和牙釉質(zhì)中的蛋白結(jié)合生成不溶性的物質(zhì)。所以，紫地榆對(duì)牙釉質(zhì)的抗酸保護(hù)作用強(qiáng)，而對(duì)再礦化的影響不及氟化鈉、氯化鑭等化學(xué)試劑所直接引發(fā)的離子取代及補(bǔ)給。影響牙釉質(zhì)硬度值改變的具體作用物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究確定。

本實(shí)驗(yàn)采用表面顯微硬度測(cè)試(Surface microhardne，SMH)。其原理是，測(cè)試時(shí)，壓頭垂直壓向脫礦標(biāo)本的自然表面，停留一定時(shí)間，使標(biāo)本產(chǎn)生永久性變形，用顯微鏡測(cè)出壓痕的尺寸。該方法不僅能夠提供礦物質(zhì)損失與獲得的間接證據(jù)，其結(jié)果還與釉質(zhì)標(biāo)本測(cè)試區(qū)下方的礦物含量明顯相關(guān)，可指明礦物的分部輪廓。因此，廣泛應(yīng)用于牙齒釉質(zhì)脫礦與再礦化的研究［14］。但存在以下缺點(diǎn):結(jié)果只能定性;需要一個(gè)平坦的測(cè)試面;齲損的形狀，礦物質(zhì)的再分布情況等因素可能影響測(cè)試結(jié)果;只有在一定的齲損深度范圍內(nèi)，壓痕的長度與齲損深度才呈線性相關(guān)關(guān)系［15］。以上因素可能會(huì)給實(shí)驗(yàn)帶來一定影響，實(shí)驗(yàn)過程中，測(cè)試平面的人工打磨盡可能保持一致，確保礦物含量在同一水平，以減少人為誤差。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)氟化鈉、氯化鑭、紫地榆乙醇提取物再礦化處理后的牙釉質(zhì)表層顯微硬度都明顯增加，證明氟化鈉、氯化鑭、紫地榆乙醇提取物都有促進(jìn)脫礦釉質(zhì)再礦化的效用，作用由強(qiáng)到弱的順序依次為氯化鑭＞氟化鈉＞紫地榆乙醇提取物。天然植物藥防齲的研究具有鮮明的地域特性。天然藥物紫地榆乙醇提取物對(duì)牙體硬組織的再礦化有顯著的促進(jìn)作用，其促進(jìn)再礦化的作用雖不及預(yù)防齲齒最常用的藥物氟化鈉和氯化鑭，但卻具有天然藥物所特有的安全性，且廣泛分布于云南省境內(nèi)，原藥資源豐富，有進(jìn)一步研究與開發(fā)的價(jià)值。

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