【作 者】劉成虎，吳平，施燕平，王敏

1 國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心

2 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評價重點實驗室

3 山東恒信檢測技術(shù)開發(fā)中心

近年來，隨著醫(yī)療器械生物學(xué)評價方法學(xué)研究的不斷深入，醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)的研究已逐漸成為醫(yī)療器械生物學(xué)評價的熱點領(lǐng)域之一。眾所周知，醫(yī)療器械中含有的免疫原是導(dǎo)致其免疫毒性的原因。因此，如何對醫(yī)療器械中含有的免疫原進行評價是控制相關(guān)產(chǎn)品免疫毒性的關(guān)鍵所在。有鑒于此，ISO/TC194 于2006年就推出了ISO/TS 10993-20《醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗原則和方法》[1]，然而，由于應(yīng)用于醫(yī)療器械的免疫毒理學(xué)方面的標(biāo)準(zhǔn)化試驗尚未不成熟。因此，在該ISO技術(shù)規(guī)范中沒有給出具體的試驗方法。本文通過對醫(yī)療器械的免疫毒理學(xué)知識的介紹，以期能幫助大家對醫(yī)療器械免疫學(xué)評價的理解，更好地使用ISO/TS 10993-20，從而為建立一套完整的醫(yī)療器械免疫原性風(fēng)險評價體系，有效降低醫(yī)療器械臨床使用時的免疫毒理學(xué)風(fēng)險奠定基礎(chǔ)。

1 醫(yī)療器械中免疫原引起的免疫毒性效應(yīng)

醫(yī)療器械中含有的免疫原是其引發(fā)免疫毒性反應(yīng)的根本原因。免疫原是可能會刺激機體發(fā)生免疫應(yīng)答的異源性物質(zhì)。在考慮醫(yī)療器械中免疫原潛在的免疫毒性危害時，應(yīng)充分考慮器械與人體的接觸方式、接觸時間對免疫毒性效應(yīng)的影響。GB/T16886.1/ISO 10993-1中所列出的每一種接觸方式都有可能引起免疫毒性反應(yīng)[2]。其中，皮膚和粘膜接觸可能誘發(fā)I型和IV型超敏反應(yīng)。不含免疫原物質(zhì)的器械與機體長時間接觸也有可能在機體內(nèi)產(chǎn)生免疫原，一般來說，接觸時間越長，產(chǎn)生的免疫原的可能性越大。與機體接觸24 h以上的器械發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)也可被認(rèn)為是具有免疫原性。

1.1 超敏反應(yīng)

超敏反應(yīng)一般分為四種類型。常見的由醫(yī)療器械引發(fā)的超敏反應(yīng)主要有兩類。即由IgE抗體介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)（速發(fā)型超敏反應(yīng)）和由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅳ型超敏反應(yīng)（遲發(fā)型超敏反應(yīng)）。Ⅰ型超敏反應(yīng)也是最嚴(yán)重的超敏反應(yīng)。Ⅱ型和Ⅲ型超敏反應(yīng)涉及到抗體（IgG或IgM，但是沒有IgE）和補體，發(fā)生率相對較低，醫(yī)療器械一般不會發(fā)生這兩種超敏反應(yīng)。

1.2 慢性炎癥反應(yīng)

眾所周知，炎癥是局部損傷后的修復(fù)反應(yīng)，是機體的一種保護機制。其中，急性炎癥反應(yīng)一般持續(xù)時間較短，并伴有機體局部的紅腫熱痛和功能障礙。與急性炎癥反應(yīng)不同，慢性炎癥反應(yīng)一般可持續(xù)數(shù)月或更長時間，其特征為巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，并形成免疫性肉芽腫和更為嚴(yán)重的免疫毒性反應(yīng)，如自身免疫性疾病等。對于長期接觸或永久性植入物導(dǎo)致的慢性炎癥，還有可能導(dǎo)致植入物的成分與骨質(zhì)相連，形成致密的假性囊腔及其它嚴(yán)重后果。GB/T16886.6/ISO10993-6中對植入后局部炎癥反應(yīng)作出了詳細(xì)地描述[3]。

1.3 免疫抑制

免疫抑制可導(dǎo)致機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抑制，宿主抵抗力下降和經(jīng)常性的嚴(yán)重感染。截至目前，尚無器械/材料導(dǎo)致免疫抑制的確切證據(jù)，與免疫抑制相關(guān)的免疫毒理實驗還是僅限于一般的毒性測試階段。

1.4 免疫刺激

免疫刺激主要為器械/材料中的免疫原性成分刺激機體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答(如抗體和/或淋巴細(xì)胞對外源蛋白的免疫應(yīng)答)。一般情況下，免疫刺激不會導(dǎo)致機體對疾病的抵抗力降低。然而，不適當(dāng)?shù)目乖禺愋曰蚍翘禺愋源碳っ庖呦到y(tǒng)，有可能會加劇現(xiàn)有的過敏或自身免疫癥狀。

1.5 自身免疫

某些器械/材料接觸人體后，可與組織或血清蛋白結(jié)合，改變蛋白的構(gòu)象，使得機體可對這些修飾后的自身抗原進行識別，產(chǎn)生自身抗體或T淋巴細(xì)胞與宿主的自身抗原發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷或組織破壞，并可能導(dǎo)致慢性、消耗性自身免疫性疾病，或重要組織和器官的損傷。自身免疫一般表現(xiàn)為較高的個體差異性，影響因素眾多，并且由于種屬間有差異性，很難用動物模型進行模擬。

2 含免疫原的醫(yī)療器械產(chǎn)品類型

在醫(yī)療器械的眾多組分中，蛋白質(zhì)作為免疫原性物質(zhì)的可能性最大，其次是多糖、核酸和脂質(zhì)。小分子量的物質(zhì)通常沒有免疫原性，然而，它們可以通過與宿主蛋白結(jié)合并改變蛋白的構(gòu)象來獲得免疫原性。生物源性的材料，如膠原，乳膠蛋白和動物組織中含有的免疫原都有可能刺激機體發(fā)生免疫應(yīng)答。常見的含免疫原的醫(yī)療器械主要包括以下幾種類型。

2.1 組織工程類產(chǎn)品和同種異體移植物

組織工程類產(chǎn)品和同種異體移植物是近年來發(fā)展較快的一類醫(yī)療器械類產(chǎn)品。機體針對該類產(chǎn)品發(fā)生的免疫毒性反應(yīng)主要為移植排斥反應(yīng)。其中，最常見的是同種異型移植排斥反應(yīng)，即由受者的T細(xì)胞介導(dǎo)的，針對該類產(chǎn)品中的免疫原進行的免疫應(yīng)答，主要涉及直接識別和間接識別兩種機制（見表1）。因此，組織工程類產(chǎn)品和同種異體移植物在加工過程中，除了要對潛在的病毒感染因子進行滅活以外，另一項很重要的工序就是去除或降低產(chǎn)品的免疫原性，減少產(chǎn)品使用過程中發(fā)生的急性和慢性排斥反應(yīng)，以保證產(chǎn)品發(fā)揮其預(yù)期的功能。

表1 直接識別和間接識別的比較Tab.1 Comparisons between direct recognition and indirect recognition

2.2 動物源類產(chǎn)品

醫(yī)療器械中來源于動物組織的材料非常范圍，這些材料可構(gòu)成器械的主要部分(如牛/豬心臟瓣膜、用于口腔科或整形外科的骨替代物、止血器械）、產(chǎn)品的涂層或浸滲（如膠原、明膠、肝素）或用于器械制造過程（如油酸鹽和硬脂酸鹽等動物脂衍生物、胎牛血清、酶、培養(yǎng)基）。這些產(chǎn)品在使用過程中，產(chǎn)品中殘留的動物組織蛋白、DNA以及包膜抗原等都可能會與患者的免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生免疫毒理學(xué)效應(yīng)，其實質(zhì)也為機體免疫系統(tǒng)針對異種移植物的排斥反應(yīng)。因此需在加工過程中對其免疫原性進行清除或降低。

2.3 乳膠類產(chǎn)品

乳膠產(chǎn)品中由于含有乳膠蛋白質(zhì)，當(dāng)人體接觸后，蛋白可選擇誘導(dǎo)特異性B細(xì)胞發(fā)生IgE抗體應(yīng)答，產(chǎn)生表面結(jié)合特異性IgE的致敏肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞。當(dāng)機體再次接觸相同的乳膠蛋白時，會與致敏肥大細(xì)胞/嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE抗體結(jié)合，從而引發(fā)Ⅰ型超敏反應(yīng)。目前已經(jīng)證實，天然乳膠中的幾種蛋白質(zhì)能與IgE結(jié)合，并可以引發(fā)Ⅰ型超敏反應(yīng)[4]。

2.4 聚合物、陶瓷制品及金屬

對于醫(yī)療器械而言，聚合材料、陶瓷制品及金屬材料中潛在的可瀝濾物、磨損或可降解成分，可與宿主蛋白結(jié)合而具有免疫原性。以金屬材料為例，金屬醫(yī)療器械中可引起超敏反應(yīng)的金屬有很多種，主要有鎳、鈷、鉻、汞等。其中，鎳所引起的金屬過敏最為常見。鎳可極少量溶解于人的體液中，并與組織中的蛋白質(zhì)結(jié)合，改變組織蛋白的構(gòu)象，從而被機體的抗原遞呈細(xì)胞識別、加工和處理，以抗原肽和MHC-II/I類分子復(fù)合物的形式表達于抗原遞呈細(xì)胞表面，進而活化具有相應(yīng)抗原受體的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，并在細(xì)胞因子作用下增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞或記憶性T細(xì)胞。當(dāng)記憶性T細(xì)胞再與鎳蛋白復(fù)合物接觸后，即可迅速增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞，從而引發(fā)Ⅳ型超敏反應(yīng)。同時，有些金屬（如鎳和汞）也可能在某些受試者體內(nèi)引發(fā)免疫抑制，但具體機制不詳。

3 醫(yī)療器械免疫原性評價策略

當(dāng)前生物相容性試驗中免疫原性方面的知識非常有限的。一方面缺少簡單、可靠和敏感的方法。另一方面，雖然有些免疫學(xué)實驗已被證實為有效的方法，但是在許多情況下，其生物學(xué)意義和預(yù)示價值仍需要慎重考慮。與其他醫(yī)療器械生物相容性試驗相似，免疫原評價方法也分為體外試驗、半體內(nèi)試驗和動物試驗三種方式。其中，最為重要的就是通過在嚙齒類動物體內(nèi)試驗的方法來研究和評價材料的免疫學(xué)效應(yīng)。同樣，在進行動物實驗時，為了與GB/T 16886.2/ISO 10993-2中的要求一致，我們需要考慮到所有可能的和實際上能做到的替代方法[5]。從試驗性質(zhì)上看，免疫原評價的方法又可分為非功能性試驗和功能性試驗兩種類型。預(yù)期構(gòu)建的免疫原性評價的框架如圖1所示。

圖1 免疫原性評價的框架Fig.1 Framework for immunogenic evaluation

3.1 非功能性試驗

非功能性試驗主要是針對免疫器官重量，大體形態(tài)，淋巴組織的改變程度，淋巴細(xì)胞的數(shù)量和免疫球蛋白的水平以及其他免疫功能指標(biāo)水平的改變加以描述。它是目前采用廣泛的評價方法。

3.2 功能性試驗

非功能試驗具有易操作、檢測迅速的特點，然而，要想全面客觀的評價醫(yī)療器械的免疫毒性，就必須進行相關(guān)的功能性試驗研究。功能性試驗是用來檢測細(xì)胞和/或器官的活性，大體分為體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩大類。前者常見的試驗有使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對免疫球蛋白功能的檢測以及補體活性的檢測。后者常見的試驗有淋巴細(xì)胞對絲裂原或特異性抗原的增殖反應(yīng)，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，自然殺傷（NK）細(xì)胞的活性以及致敏試驗等。

4 結(jié)語

目前，醫(yī)療器械導(dǎo)致人體潛在免疫毒性作用方面的全身研究是非常缺乏的，部分原因可能是因為在材料的早期研發(fā)階段就已經(jīng)進行了免疫原性的篩選。但是，缺乏科學(xué)、完整的適用于醫(yī)療器械免疫原性評價程序和試驗方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)體系也是不容忽視的原因。同時，隨著大量新型醫(yī)療器械的不斷涌現(xiàn)，以及新的免疫學(xué)技術(shù)如流式細(xì)胞術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)及基因芯片技術(shù)等在醫(yī)療器械免疫原性評價中的應(yīng)用，使我們對醫(yī)療器械中免疫原的識別以及其基本分子結(jié)構(gòu)進行定性分析成為可能。相信將來也一定會形成一套能有效保證醫(yī)療器械免疫原性安全的檢測方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)體系。

[1] ISO/TS 10993-20:2006, Biological evaluation of medical devices–Part 20: Principles and methods for immunotoxicology testing of medical device [S].

[2] ISO 10993-1:2009, Biological evaluation of medical devices–Part 1: Evaluation and testing within a risk management process [S].

[3] ISO 10993-6:2007, Biological evaluation of medical devices-Part 6:Tests for local effects after implantation[S].

[4] Akasawa A, Hsieh L-S, Lin Y, Serum reactivities to latex proteins(Hevea brasiliensis)[S]. J Allergy Clin Immunol 1995, 95:1196-1205.

[5] ISO 10993-2:2006, Biological evaluation of medical devices-Part 2:Animal welfare requirements[S].