劉義鑫,潘靈輝,林 飛,葛萬運,楊 建

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科,南寧 530021)

肺組織低氧代謝中葡萄糖轉運蛋白1的表達及其作用*

劉義鑫,潘靈輝△,林 飛,葛萬運,楊 建

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科,南寧 530021)

目的探討單肺通氣對大鼠肺組織葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)表達的影響?方法 30只Sprague Dawley大鼠經10%水合氯醛4.5mL/kg腹腔注射麻醉后行氣管插管術,建立單肺通氣模型,將建模后大鼠隨機分為對照組(n=6)與實驗組(n=24),對照組大鼠采用主支氣管插管雙肺通氣;實驗組大鼠均為右主支氣管插管通氣,左側肺不通氣,按左側肺不通氣時間隨機分為實驗0.5h組?實驗1.0h組?實驗2.0h組及實驗4.0h組,每組6只?采用透射電子顯微鏡觀察大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞(AECⅡ)超微結構,半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測大鼠肺組織GLUT1mRNA的表達情況?結果對照組AECⅡ細胞核內染色質分布均勻,細胞質內板層小體圓形且密度均勻,微絨毛清晰?各實驗組AECⅡ的細胞核染色質?細胞質內板層小體?細胞膜及微絨毛等有不同程度的改變?與對照組比較,實驗0.5h組?實驗1.0h組大鼠肺組織GLUT1mRNA表達量顯著降低(P0.05);實驗2.0h組大鼠肺組織GLUT1mRNA表達量略有降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);實驗4.0h組大鼠肺組織GLUT1mRNA表達量明顯增加(P0.05)?除實驗1.0h組與實驗0.5h組大鼠肺組織GLUT1mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義外(P0.05),其余各實驗組兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)?結論低氧條件下,肺組織GLUT1mRNA的上調對AECⅡ具有保護作用?

肺通氣;細胞低氧;肺泡上皮細胞;葡萄糖轉運蛋白;大鼠

單肺通氣麻醉目前已廣泛應用于臨床?單肺麻醉時一側肺完全萎陷,萎陷肺的血流灌注明顯下降,肺組織缺氧[1]?肺泡細胞在缺氧時,依靠無氧酵解獲取能量,這意味著肺泡細胞需要攝取大量葡萄糖以滿足機體的正常代謝?葡萄糖轉運蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)是GLUT家族成員之一,主要負責細胞內?外葡萄糖的跨膜轉運,對調節(jié)機體糖代謝發(fā)揮關鍵作用?目前國內?外尚未見在低氧環(huán)境下肺泡細胞GLUT1表達的相關報道?本研究通過分析不同時間低氧對肺泡細胞中GLUT1mRNA表達的影響,探討在低氧環(huán)境下肺泡細胞GLUT1mRNA的表達及其作用?

1 材料與方法

1.1 動物 健康Sprague Dawley大鼠30只,不分雌雄,體質量(240.0±20.0)g,由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供?

1.2 動物單肺通氣模型的建立及分組 實驗前大鼠禁食8h,不限制飲水?用10%水合氯醛4.5mL/kg腹腔注射麻醉,氣管切開后行氣管插管術,通氣設置:潮氣量5mL/kg?呼吸頻率80次/min?吸呼比(inspiratory expiratory ratio,I:E)為1∶2,呼氣末正壓通氣(postive end-expiratory pressure,PEEP)6cm H2O?吸入氧體積分數(fraction of inspire O2,FiO2)為1.0?將建模后大鼠隨機分為對照組(n=6)與實驗組(n=24),對照組大鼠采用主支氣管插管雙肺通氣;實驗組大鼠均為右主支氣管插管通氣,左側肺不通氣,按左側肺不通氣時間隨機分為實驗0.5h組?實驗1.0h組?實驗2.0h組及實驗4.0h組,每組6只?

1.3 透射電鏡檢測 取各組大鼠左肺下葉組織(1mm3)置于4℃?2%戊二醛液(pH 7.4)中固定,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)沖洗?鋨酸固定?乙醇脫水?丙酮脫水?環(huán)氧樹脂Epon812包埋?100%丙酮浸透,采用LKB-Ⅴ電鏡切片機(瑞典LKB公司)制成超薄切片,醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色后,H-500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)觀察組織?細胞超微結構?

1.4 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR) Trizol法提取大鼠左?右肺下葉組織總RNA,按逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)說明進行逆轉錄獲取cDNA,自動PCR儀(Light Cycle,美國Roche公司)擴增?GLUT1及內參β-actin引物由上海生物工程技術服務有限公司合成?GLUT1上游引物:5′-GGA GAC GCA TAG TCA CAG AAC G-3′,下 游 引 物:5′-GCC AAA GCG ATT AAC AAA GAG-3′,擴增產物長度為348bp;內參β-actin上游引物:5′-AGA TGT ACG TAG CCA TCC-3′,下游引物:5′-CTC TCA GCT GTG GTG GTG AA-3′,擴增產物長度為228bp?GLUT1循環(huán)條件:95℃預變性5min;94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸90s,共33個循環(huán);最后72℃延伸10min,4℃保存?擴增結束后取8μL PCR產物經2%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠成像獲取的圖片經Quantity One v462軟件(美國Biorad公司)進行分析,以目的條帶與內參灰度值的比值反映GLUT1mRNA的表達?

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,計量數據用±s表示,組間比較采用方差分析和SNK(Student-Newman-Keuls)法檢驗(方差齊)及矯正t檢驗(方差不齊),以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義?

2 結 果

2.1 大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell typeⅡ,AECⅡ)的透射電鏡觀察 對照組大鼠AECⅡ:細胞核及其邊界清晰,細胞核內染色質分布均勻;細胞質內板層小體圓形且密度均勻正常;細胞膜連續(xù)完整,微絨毛清晰,見圖1?實驗0.5h組大鼠AECⅡ:細胞核及其邊界清楚,細胞核內染色質分布均勻;細胞質內板層小體數目減少,體積增大,呈環(huán)狀排列;微絨毛排列較整齊,見圖2?實驗1.0h組大鼠AECⅡ:細胞核及其邊界清楚,核仁偏移,細胞核內染色質不清;細胞質內板層小體體積增大,密度減小;微絨毛排列紊亂,見圖3?實驗2.0h組大鼠AECⅡ:細胞核及其邊界清楚,細胞核變形,核仁碎裂,染色質分布不均勻;細胞質內板層小體相對密度降低,數目減少,體積增大,伴有空泡樣變,微絨毛消失,見圖4?實驗4.0h組大鼠AECⅡ:細胞核?核仁碎裂呈2個,細胞核內染色質不清;細胞質內板層小體空泡樣變,并向細胞外排出;細胞膜結構不完整,見圖5?

2.2 大 鼠 肺 組 織 中GLUT1mRNA的 表 達 RT-PCR結 果 分析表明,與對照組比較,實驗0.5h組?1大鼠肺織GLUT1mRNA表達量顯著降低(P0.05);實驗2.0h組大鼠肺組織GLUT1mRNA表達量略有降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);實驗4.0h組大鼠肺組織GLUT1mRNA表達量明顯增加(P0.05)?除實驗1.0h組與實驗0.5h組大鼠肺組織GLUT1mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義外(P0.05),其余各實驗組兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),見圖6?與對照組比較,實驗1.0h組右肺下葉組織GLUT1mRNA的表達量降低(P0.05)?見表1?圖6?

圖1 對照組大鼠AECⅡ的超微結構(×2 800)?

圖2 實驗0.5h組大鼠AECⅡ的超微結構(×4 800)

圖3 實驗1.0h組大鼠AECⅡ的超微結構(×4 800)

表1 對照組大鼠肺組織與實驗1.0h組右肺下葉組織GLUT1mRNA表達的比較(±s,n=6)

表1 對照組大鼠肺組織與實驗1.0h組右肺下葉組織GLUT1mRNA表達的比較(±s,n=6)

*:P0.05,與對照組比較?

組別GLUT1mRNA對照組0.36±0.07實驗1.0h組右肺下葉組織 0.13±0.05*

圖4 實驗2.0h組大鼠AECⅡ的超微結構(×7 700)

圖5 實驗4.0h組大鼠AECⅡ的超微結構(×5 900)

圖6 各組大鼠肺組織GLUT1mRNA表達的電泳圖

3 討 論

單肺通氣技術已廣泛應用于胸外科手術,單肺通氣技術使一側肺通氣,一側肺萎陷停止呼吸,為手術提供良好的視野,由于大部分手術都能在4.0h內完成,因此,本研究選擇單肺通氣時間為0.5～4.0h?

單肺通氣期間,非通氣側肺的血液沒有得到氧合,其動脈血與靜脈血摻雜,肺組織缺氧,導致肺組織細胞損傷及功能損害[1-2]?葡萄糖是肺泡細胞主要的能源物質?正常情況下,肺泡細胞主要靠葡萄糖的有氧代謝獲取能量;而缺氧時,肺泡細胞主要靠葡萄糖的無氧酵解獲取能量?1分子葡萄糖無氧酵解可凈生成2分子ATP,而有氧氧化可凈生成38分子ATP?因此,為了維持肺泡細胞所需的能量,細胞需要攝取大量葡萄糖?細胞攝取葡萄糖主要通過GLUT,GLUT家族中GLUT1是哺乳動物細胞內參與葡萄糖跨膜轉運的主要載體,GLUT主要功能是跨膜將葡萄糖分子轉運入細胞內?目前發(fā)現GLUT共有13個成員,分別命名為GLUT 1～12和H+-肌醇轉 運 體 (H+myo-inositol transporter,HMIT)[3]? 其 中,GLUT1是介導細胞葡萄糖攝取的主要載體,在人體各組織?細胞中廣泛存在,與代謝密切相關,主要介導細胞內外的跨膜轉運,調節(jié)葡萄糖攝取,對糖代謝的調節(jié)功能發(fā)揮關鍵作用[4]?GLUT1的 表 達 受 多 種 因 素 的 影 響 ,缺 氧 誘 導 因 子1?降 糖 藥 ?腫瘤壞死因子?葡萄糖生長激素轉化β成纖維細胞生長因子1和癌基因等均可上調GLUT1mRNA的表達[5]?本研究結果表明,隨著低氧時間延長,尤其是單肺通氣達到4h時,大鼠AECⅡ超微結構破壞越嚴重,細胞結構受破壞的程度與缺氧時間成正比?GLUT1是慢性缺氧的標記物[6],低氧時,GLUT1基因表達和轉運能力增強,同時低親和力的GLUT1被激活向細胞膜轉位,使組織細胞攝取葡萄糖的能力增強?在缺氧的情況下,低氧誘導因子-1α(hypoxia induced factor 1α,HIF1α)表達急劇升高,激活 GLUT1 5′端的增強子序列,從而引起GLUT1mRNA的大量表達[7]?本研究表明實驗0.5h組及實驗1.0h組的大鼠肺組織GLUT1mRNA的表達量下調,由此,本研究增加了檢測通氣右肺下葉組織,結果右下肺組織通氣1.0h后的GLUT1mRNA的表達量同樣出現下調,說明在單肺通氣0.5～1.0h時,肺血管缺氧性收縮產生肺內分流,代償性保證了非通氣左肺組織的氧供給,兩側肺泡細胞攝氧是平衡均等并能滿足肺泡細胞能量代謝的需要,因此,出現GLUT1mRNA表達量下調?實驗研究表明,在單肺通氣超過2h后,肺泡細胞處于低氧代謝環(huán)境,AECⅡ的形態(tài)?結構和功能受到影響,AECⅡ凋亡?裂解?壞死,導致AECⅡ的數量減少,而其在短時間內不能得到補充和代償,從而啟動了GLUT1調控?因此,本實驗中,大鼠肺組織GLUT1mRNA從低氧2.0h開始上調,低氧4.0h時GLUT1mRNA的表達量顯著增加?Stein等[8]發(fā)現低氧時GLUT1mRNA的半衰期從0.52h增加到8.00h?Ouiddir等[9]報道,AECⅡ的GLUT1在低氧誘導下活性明顯提高,在復氧后GLUT1的活性迅速降低?由此可見,低氧刺激誘導了GLUT1的表達及其活性增加,從而保證糖代謝的速率?

單肺通氣可以使通氣/血流比例失衡,增加肺內分流導致低氧血癥[10]?有研究發(fā)現,單肺通氣超過2.0h,氧合指數小于300;超過3.0h,氧合指數為216,達到急性肺損傷的診斷標準[11]?單肺通氣可引起缺氧性肺損傷,甚至發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征 (acute respiratory distress syndrome,ARDS)?缺氧時,肺泡細胞無氧代謝增加,能量匱乏,GLUT1基因表達和轉運能力增強使肺泡細胞攝取葡萄糖能力增強[12],這有助于恢復肺泡細胞的能量代謝,減少組織?細胞的損害[13],對AECⅡ具有保護作用?有研究發(fā)現GLUT1表達的增加可修復缺氧對組織?細胞的損害,它可通過激活c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinases,JNK)信號途徑阻止缺氧誘導的細胞凋亡[14]?進一步研究缺氧條件下肺組織GLUT1的調控機制可能對防治缺氧性肺損傷,甚至ARDS,均有重要意義?

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Expression of glucose transporter 1 and its effects in lung tissue of hypoxic metabolism*

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(,,, 530021,)

ObjectiveTo explore the effect of one-lung ventilation on the expression of glucose transporter 1(GLUT1)in lung tissue of rats.Methods30Sprague Dawley rats were subjected to anesthesia by intraperitoneal injection of 10%chloral hydrate 4.5mL/kg,followed by endotracheal intubation to establish rat models of one-lung ventilation.Rats after modeling were randomly divided into control group(n=6)and experimental group(n=24).Lung ventilation using main-stem bronchial intubation was conducted in rats in the control group,and in the experimental group,lung ventilation was performed through right main-stem bronchial intubation with no ventilation in the left lung.Rats in the experimental group were subdivided into experimental 0.5hgroup,experimental 1.0hgroup,experimental 2.0hgroup and experimental 4.0hgroup,according to the duration of non-ventilation in the left lung.Transmission electron microscopy was employed to observe the ultrastructure of alveolar epithelial cell typeⅡ(AECⅡ)of rats and semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)was adopted to detect the expression ofGLUT1 mRNA in lung tissue of rats.ResultsAECⅡin control group showed nuclear chromatin with well-distribution,cytoplasmic lamellar bodies with round shape and uniform density,and clear microvilli.AECⅡin each experimental group were found different degrees of changes in nuclear chromatin,cytoplasmic lamellar bodies and microvilli.Compared with the control group,expression ofGLUT1mRNA was significantly decreased in lung tissue of rats in experimental 0.5hgroup and experimental 1.0hgroup(P0.05),it was slightly reduced in experimental 2.0hgroup with no statistically significance,and it was markedly increase in experimental 4.0hgroup(P0.05).Paired comparison among experimental groups,except the comparison between experimental 1.0h group and experimental 0.5hgroup,differences were statistically significant(P0.05).ConclusionIn the condition of hypoxia,the up-regulation ofGLUT1mRNA in lung tissue possesses the protective effect on AECⅡ.

pulmonary ventilation;cell hypoxia;alveolar epithelial cells;glucose transporters;rats

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.09.015

A

1671-8348(2012)09-0872-03

廣 西 壯族自 治 區(qū) 科 學 技術自 然 基 金 資 助項目(桂 科 自0991235);廣 西醫(yī) 療 衛(wèi) 生 重 點 科研 課 題 資 助 項 目 (重2010070)?△

,Tel:(0771)5320919;E-mail:plinghui@yahoo.com

2011-11-21

2012-01-08)

?臨床研究?