閻 豐， 楊志明， 劉 娟

(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院心內(nèi)科，山西太原030001)

動脈粥樣硬化斑塊形成是冠心病的病理學基礎，泡沫細胞的形成在動脈粥樣斑塊的形成中起著重要的作用［1］。三磷酸腺苷結合盒轉運子A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是細胞膜上重要的膽固醇流出調節(jié)蛋白，它介導的細胞內(nèi)膽固醇流出是膽固醇逆轉運(reverse cholesterol transport，RCT)的起始環(huán)節(jié)［2］。環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是細胞內(nèi)重要的第二信使，亦是調節(jié)ABCA1表達的重要因子［3］。血管緊張素-(1-7)［angiotensin-(1-7)，Ang-(1-7)］是近幾年發(fā)現(xiàn)的可拮抗血管緊張素Ⅱ(angiotensinII，Ang II)的一種激素，它通過和Mas受體結合起到抗炎、抑制血管平滑肌增殖的作用［4］。通過前一階段研究，我們已證明Ang-(1-7)可以使單核細胞ABCA1蛋白表達增加，膽固醇流出率增加。那么cAMP是否在Ang-(1-7)影響泡沫細胞ABCA1的表達過程中起作用呢?尚缺乏充分證據(jù)。本實驗通過分別對泡沫細胞施加Ang-(1-7)和腺苷酸環(huán)化酶抑制劑MDL(MDL-12，330A)因素，觀察泡沫細胞ABCA1表達及膽固醇含量的變化。

材料和方法

1 材料

人THP-1單核細胞株購自中科院上海細胞庫，RPMI-1640培養(yǎng)基購于 HyClone，Ang-(1-7)、MDL和佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)均購于Sigma，鼠抗人ABCA1Ⅰ抗購自 Santa Cruz，羊抗鼠Ⅱ抗購于武漢博士德公司，膽固醇標準品購于中國藥品生物制品檢定所，氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)購于北京欣和佳源公司，RNAiso Plus總RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量試劑盒均購自TaKaRa，［3H］膽固醇購于American Life Science，ABCA1和 β-actin引物購自上海生工生物工程有限公司，油紅O試劑購于北京索萊寶公司，甲醇、異丙醇和乙腈為天津市河東區(qū)紅巖試劑廠產(chǎn)品，CO2培養(yǎng)箱購自Thermo，高效液相色譜儀購自Waters。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將人THP-1單核細胞懸浮于含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。顯微鏡下可見細胞呈球形、懸浮生長。根據(jù)細胞生長情況換液、傳代。選取生長良好的3～5代細胞進行實驗研究。實驗前在培養(yǎng)液中加入160 nmol/L PMA孵育THP-1細胞24 h，誘導單核細胞分化為巨噬細胞，顯微鏡下觀察細胞可見細胞由懸浮狀態(tài)向貼壁狀態(tài)轉化，伸出偽足，呈現(xiàn)巨噬細胞形態(tài)。換液后加入50 mg/L ox-LDL，培養(yǎng)48 h，使其變成泡沫細胞。換含15%胎牛血清的培養(yǎng)液后加入干預因素。實驗分為4組:(1)泡沫細胞組:不加干預因素;(2)MDL組:加MDL 10 mmol/L;(3)Ang-(1-7)組:加 Ang-(1-7)1 000 nmol/L;(4)MDL+Ang-(1-7)組:分別加10 mmol/L MDL和1 000 nmol/L Ang-(1-7)。

2.2 泡沫細胞模型的鑒定 采用Lillie氏油紅O染色法。將THP-1源性單核細胞接種于6孔板中，按上述方法誘導泡沫細胞模型。后棄上清，PBS洗3次，加10%甲醛固定15 min，PBS洗3次，60%異丙醇漂洗1次20～30 s，稀釋油紅O儲存液，油紅O∶去離子水=3∶2，濾紙過濾4～5次，室溫放置10 min，染色15 min左右，經(jīng)60%異丙醇分化數(shù)秒鐘，水洗1～2 min，用稀釋1倍的明礬蘇木素染液淡染細胞核30 s，水洗返藍，顯微鏡下觀察并攝像。

2.3 ELISA檢測各組cAMP的含量 各組細胞處理后，樣品棄上清，PBS洗3次，刮刀刮取細胞，置于離心管中，用1 mL注射器反復抽吸裂解細胞，每孔分別加入標準品和上述裂解液各100 μL，將反應板充分混勻后置37℃ 120 min，用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干，每孔中加入第Ⅰ抗體工作液100 μL，將反應板充分混勻后置于37℃ 60 min洗板同上，每孔加酶標抗體工作液100 μL，將反應板置于37℃ 30 min，洗板同前，每孔加入底物工作液100 μL，置于37℃暗處反應15 min。每孔加入100 μL終止液混勻。30 min內(nèi)用酶標儀在450 nm處檢測吸光度值。制定cAMP標準曲線，根據(jù)公式y(tǒng)=3.4603 × x1.0629/(6.00151.0629+x1.0629)計算各組cAMP數(shù)值。

2.4 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(realtime RT-PCR)檢測ABCA1 mRNA的表達 使用Trizol提取總RNA，按試劑盒說明(TaKaRa)逆轉錄成cDNA。以ABCA1 cDNA為模板，ABCA1上游引物P1為aacagtttgtggcccttttg，下游引物P2為agttccaggctggggtactt。按兩步法進行反應:95℃預變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，擴增40個循環(huán)。實驗重復3次，取平均值，根據(jù)以下相對定量公式計算:待測樣本相對量 =2-ΔΔCt，ΔΔCt= ΔCt內(nèi)參照- ΔCt待測樣品，ΔCt=Ct陰性對照-Ct待測樣品。

2.5 Western blotting檢測 ABCA1蛋白的表達 胰蛋白酶消化、離心收集細胞，PBS洗滌3次后加入細胞裂解液，4℃、12 000×g離心15 min，提取細胞總蛋白。經(jīng)12%SDS聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白，電轉膜法將蛋白轉移到硝酸纖維膜上，封閉，先后加I抗、II抗，酶法顯色。顯影后掃描圖像進行統(tǒng)計學分析。

2.6 高效液相色譜儀檢測細胞內(nèi)膽固醇的含量(1)總膽固醇的提取:收集細胞冰浴超聲10 min裂解細胞，加15%KOH乙醇溶液，50℃水解2 h，用正己烷-異丙醇抽提2次，有機相液氮吹干干燥，用流動相溶液溶解搖勻，作為總膽固醇標準品的供試液。(2)游離膽固醇的提取:取細胞裂解液，加入乙醇，用正己烷-異丙醇如上法抽提2次，并液氮吹干干燥，溶解搖勻，作為游離膽固醇標準品的供試液。(3)取膽固醇標準品倍比稀釋法配成5個不同的濃度，將上述標準品溶液分別注入高效液相色譜儀，進樣量為10 μL，以膽固醇的質量濃度為橫坐標X軸，其電壓波峰面積為縱坐標Y軸，繪制標準曲線。(4)按流動相異丙醇 -乙腈(50∶50)、流速1 mL/min、柱溫40℃的色譜條件，進樣20 μL，記錄膽固醇的峰面積，代入回歸方程，計算總膽固醇量和游離膽固醇量，總膽固醇量減去游離膽固醇量為膽固醇酯的量。

2.7 閃爍計數(shù)法測定細胞內(nèi)膽固醇流出率 隨機選擇誘導好的泡沫細胞，在含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入0.37×109Bq/L［3H］標記膽固醇共同孵育48 h之后，用PBS液洗滌細胞2次，再在新培養(yǎng)液中按以上分組分別加入Ang-(1-7)、MDL和Ang-(1-7)+MDL干預因素培養(yǎng)24 h，再用PBS液洗滌細胞。在無血清含10 mg/L載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I，ApoA-I)的新培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，閃爍液裂解細胞后，用閃爍計數(shù)法檢測培養(yǎng)液和細胞的［3H］標記膽固醇。膽固醇流出率(%)=培養(yǎng)液(counts/min)值 ÷［培養(yǎng)液(counts/min)值 +細胞(counts/min)值］×100%。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 THP－1源性單核細胞、巨噬細胞及泡沫細胞的形態(tài)

將THP-1單核細胞用PMA誘導24 h后可見細胞呈梭形貼壁生長，多數(shù)細胞伸出偽足，說明細胞己分化為巨噬細胞。再用50 mg/L ox-LDL與巨噬細胞共同孵育48 h后，經(jīng)油紅O染色，顯微鏡下觀察，細胞質內(nèi)有大量的紅色脂質顆粒存在，符合泡沫細胞形態(tài)特點，見圖1。

Figure 1.The induction process of foam cells(×400).A:THP-1 monocytes;B:macrophages;C:foam cells.The THP-1 monocytes were induced to be macrophages by 160 nmol/L PMA for 48 h，followed by methanol fixation for 15 min，oil red O staining for 15 min and alum hematoxylin staining for 30 s.圖1 THP－1單核細胞、巨噬細胞和泡沫細胞的形態(tài)

2 ELISA檢測各組cAMP的含量

Ang-(1-7)組較泡沫細胞組、MDL組和Ang-(1-7)+MDL組cAMP含量明顯增加(P＜0.05);MDL組較泡沫細胞組明顯降低(P＜0.05);Ang(1-7)+MDL組介于Ang-(1-7)組與泡沫細胞組間，且與兩組有顯著差異(P＜0.05)。cAMP標準曲線見圖2，各組cAMP含量值見表1。

3 細胞內(nèi)ABCA1 mRNA的表達

以泡沫細胞中ABCA1 mRNA作為空白對照，經(jīng)Ang-(1-7)干預的泡沫細胞中ABCA1 mRNA表達較泡沫細胞、MDL組顯著增加(P＜0.05);MDL干預的泡沫細胞中，ABCA1 mRNA的表達較泡沫細胞組顯著降低(P＜0.05);MDL+Ang-(1-7)組介于泡沫細胞組與Ang-(1-7)組之間，與兩組有顯著差異(P＜0.05)，各組mRNA相對表達量見表2。

Figure 2.The standard curve of cAMP sample generated by Hill curve fitting.圖2 通過Hill曲線擬合生成的cAMP標準曲線

表1 各組細胞cAMP含量Table 1.The content of cAMP in different groups(nmol/L.±s.n=3)

表1 各組細胞cAMP含量Table 1.The content of cAMP in different groups(nmol/L.±s.n=3)

*P ＜ 0.05 vs foam cells.

Foam cells 0.9547 ±0.0031 MDL 0.8508 ±0.0060*Ang-(1-7) 1.1397 ±0.0020*Ang-(1-7)+MDL 1.0693 ±0.0028*

表2 細胞內(nèi)ABCA1 mRNA的表達Table 2.The expression of ABCA1 mRNA in different groups(%.±s.n=3)

表2 細胞內(nèi)ABCA1 mRNA的表達Table 2.The expression of ABCA1 mRNA in different groups(%.±s.n=3)

*P ＜ 0.05 vs foam cells.

Foam cells 1.0000 ±0.0000 MDL 0.8945 ±0.0201*Ang-(1-7) 1.8966 ±0.0272*MDL+Ang-(1-7) 1.5873 ±0.0110*

4 各組細胞ABCA1蛋白的表達

泡沫細胞組、MDL組、Ang(1-7)+MDL組、Ang-(1-7)組細胞ABCA1蛋白表達分別為65.05% ±6.70%、50.44% ± 1.41%、70.06% ± 4.40% 和75.20% ±1.29%。Ang-(1-7)組與泡沫細胞組、MDL組和Ang-(1-7)+MDL組比較，ABCA1表達明顯增高，差異顯著(P＜0.05)，MDL組較泡沫細胞組明顯降低(P ＜0.05)，Ang-(1-7)+MDL介于Ang-(1-7)組與泡沫細胞組之間，與泡沫細胞組比較有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖 3、4。

5 各組細胞膽固醇含量

Ang-(1-7)組與泡沫細胞組、MDL組和Ang-(1-7)+MDL組比較，膽固醇含量減低(P＜0.05)，MDL組與泡沫細胞組比較膽固醇含量增加(P＜0.05)。MDL+Ang-(1-7)組膽固醇含量介于泡沫細胞組與Ang-(1-7)組之間，與兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖5、6 及表3。

Figure 3.The expression of ABCA1 protein in different groups.1:foam cells group;2:MDL group;3:Ang-(1-7)+MDL group，4:Ang-(1-7)group.圖3 各組細胞ABCA1蛋白的表達

6 各組細胞膽固醇流出率

Ang-(1-7)組與泡沫細胞組、MDL組和Ang-(1-7)+MDL組比較，膽固醇流出率最高(P＜0.05)，MDL組與泡沫細胞組比較膽固醇流出率下降(P＜0.05)。MDL+Ang-(1-7)組膽固醇流出率介于泡沫細胞組與Ang-(1-7)組之間，與兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4。

討 論

近年研究認為，冠狀動脈粥樣硬化形成過程中，血管內(nèi)皮細胞損傷與泡沫細胞的形成在冠脈粥樣硬化的病變中起著重要的作用［5］。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)是維持機體正常水電解質平衡、血壓的重要系統(tǒng)。近年發(fā)現(xiàn)其在血管平滑肌細胞增殖和遷移及冠狀動脈粥樣斑塊形成和進展過程中起著重要的作用。Ang II是這一作用的關鍵分子，而Ang-(1-7)是血管緊張素家族的終末活性產(chǎn)物，是Ang II的內(nèi)源性拮抗因子，在心血管系統(tǒng)中起重要調控作用［6］，其與Mas受體結合后通過NO/cGMP途徑、鈣調神經(jīng)磷酸酶/T細胞活化核因子、細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)/p38、核因子κB等途徑發(fā)揮擴張血管、降低血壓、抑制平滑肌細胞增殖、利尿、利鈉及抑制新生內(nèi)膜增生等功能［7］。ABCA1是ABCA超家族的一員［8］，它以ATP為能源對包括脂質、細胞毒素和藥物等底物進行轉運，是RCT過程中的重要的蛋白。新生高密度脂蛋白主要由ApoA-I與ABCA1結合后轉運脂質，這是ABCA1介導RCT的第一步，也是限速步驟。隨后高密度脂蛋白運送脂質到肝臟以膽鹽的形式排泄。cAMP是細胞內(nèi)重要的第二信使，研究顯示cAMP通過抑制磷酸二酯酶和活化腺苷酸環(huán)化酶可調節(jié)血小板聚集及抑制血栓形成［9］。目前已證實 cAMP通過誘導ABCA1的分泌增加并降低膽固醇的循環(huán)水平，促使巨噬細胞中多余的游離膽固醇排出，從而抑制泡沫細胞的形成。其機制可能為當ApoA-I與ABCA1結合后，活化了與ABCA1偶聯(lián)的Gα，使腺苷酸環(huán)化酶激活，cAMP產(chǎn)生［10］，并作用于 SP1/3及SP1元件調節(jié)GC-Box的表達，從而導致ABCA1磷酸化，進行膽固醇生理外流調節(jié)［11］。

Figure 6.The standard curve of cholesterol stardard.圖6 膽固醇的標準曲線

表3 各組細胞內(nèi)膽固醇含量Table 3.The intracellular content of cholesterol in different groups(mg/L.±s.n=3)

表3 各組細胞內(nèi)膽固醇含量Table 3.The intracellular content of cholesterol in different groups(mg/L.±s.n=3)

*P ＜ 0.05 vs foam cells.

Foam cells 38.5833 ±0.6171 16.3500 ±0.7000 MDL 43.9500 ±0.5074* 20.9000 ±0.1803*Ang-(1-7) 25.6000 ±0.4359* 12.2500 ±0.0500*MDL+Ang-(1-7) 30.2333 ±0.5008* 13.7800 ±0.6322*

表4 各組細胞膽固醇流出率Table 4.The cholesterol efflux rates in different groups(%.±s.n=3)

表4 各組細胞膽固醇流出率Table 4.The cholesterol efflux rates in different groups(%.±s.n=3)

*P ＜0.05 vs foam cells.

Group Cholesterol efflux rate Foam cells 14.10 ±1.02 MDL 12.45 ±1.17*Ang-(1-7) 16.87 ±1.42*MDL+Ang-(1-7) 15.14 ±1.24*

通過前述研究［12-13］，我們已證明Ang-(1-7)可拮抗Ang II的作用，并通過轉錄級聯(lián)效應促進過氧化物酶體增生物激活受體γ、肝X受體α和ABCA1的表達使巨噬細胞膽固醇流出率增加。cAMP作為RCT中影響ABCA1表達的重要調節(jié)因子，在Ang-(1-7)調節(jié)膽固醇逆轉運的過程中是否起作用呢?本研究顯示，Ang-(1-7)與泡沫細胞組比較可使ABCA1表達增加，通過促進膽固醇外流，使泡沫膽固醇含量降低。MDL組與泡沫細胞組比較ABCA1表達降低，膽固醇外流減少，膽固醇含量增加。這證明cAMP在ABCA1的表達及RCT過程中起著重要的作用。Ang-(1-7)+MDL與泡沫細胞組比較ABCA1有升高趨勢，膽固醇含量降低。這表明cAMP在Ang-(1-7)作用于泡沫細胞的RCT起著十分重要的作用，但抑制cAMP的產(chǎn)生并不能完全阻斷Ang-(1-7)對泡沫細胞RCT的作用。Ang-(1-7)與Mas受體結合后，通過上述一系列信號轉導通路影響RCT的過程。

本實驗通過建立THP-1源性泡沫細胞模型，證實了Ang-(1-7)可促進泡沫細胞ABCA1 mRNA和蛋白的表達，并促進膽固醇外流使泡沫細胞膽固醇含量降低;通過MDL抑制腺苷酸環(huán)化酶的活化而減少cAMP的分泌，可部分拮抗Ang-(1-7)但不能完全阻斷它在泡沫細胞RCT中的作用，本實驗進一步探討了Ang-(1-7)在RCT過程中的影響因子及通路，提示cAMP在Ang-(1-7)促進泡沫細胞RCT及抑制動脈粥樣硬化形成過程中起著重要的作用。

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