都偉欣，楊蕾，蘇城，沈小兵，徐苗，盧錦標，王國治，陳保文

結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備和應用

都偉欣，楊蕾，蘇城，沈小兵，徐苗，盧錦標，王國治，陳保文

全球結(jié)核桿菌感染者高達 20 億人，每年新發(fā)病例約800 萬 ～ 1000 萬，其中我國每年新發(fā)患者高達 150 萬。結(jié)核桿菌流行病學的一個重要特征是結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染。結(jié)核分枝桿菌潛伏感染是一種亞臨床狀態(tài)，其中約有 10% 的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者會發(fā)展成為結(jié)核病患者[1]。流行病學調(diào)查顯示，我國受結(jié)核桿菌感染人數(shù)超過5 億。因此，如何有效、全面地篩查出結(jié)核病患者和結(jié)核桿菌潛伏感染人群，是結(jié)核病控制首要解決的問題。結(jié)核分枝桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白主要為小分子的分泌性蛋白，這些蛋白抗原是記憶性免疫 CD4+T 細胞的靶分子[2]。以早期培養(yǎng)濾液蛋白為刺激源，結(jié)合 γ 干擾素釋放技術，可以用于結(jié)核桿菌感染的體外診斷。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

H37Rv 分枝桿菌菌種（CMCC93009）由本室保存提供；超濾離心管（5000 Da）和 0.22 μm 濾器（500 ml）均購于美國 Millipore 公司；結(jié)核菌素純蛋白衍化物（PPD）（批號：20080901）由北京祥瑞生物制品有限公司提供；結(jié)核感染 T 細胞檢測試劑盒（T-SPOT.TB，批號 073），淋巴細胞分離液（批號 20090228）、RPMI1640 無血清培養(yǎng)基（批號8109040）和 AIM V 細胞培養(yǎng)液（批號 564772）均購自上海信長醫(yī)療器械有限公司；臺盼藍染液（批號 55k2342）購自美國 Sigma 公司；其余均為實驗室常用試劑。

全溫振蕩培養(yǎng)箱為東聯(lián)電子技術有限公司產(chǎn)品；冷凍離心機購自德國 Eppendorf 公司；分光光度計購自日本Shimadzu 公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；CO2孵箱購自美國 Thermo 公司；ELISPOT 讀板儀購自美國CTL 公司。1.2 方法

1.2.1 早期培養(yǎng)濾液蛋白的制備 首先將 H37Rv 分枝桿菌接種于羅氏雞蛋斜面培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng) 21 d。取斜面生長良好且無污染的菌體，用生理鹽水洗滌菌種，收集至離心桶內(nèi)，4 ℃，8000 r/min，離心 30 min，離心結(jié)束后棄去培養(yǎng)上清，收集菌體。用液體蘇通培養(yǎng)基洗滌菌體 3 次，洗滌方法為補充液體蘇通培養(yǎng)基到離心前的體積，再離心收集菌體。取液體蘇通培養(yǎng)基重懸洗滌后的菌體，將 2.5 ml 的1 × 107個/ml 的接種菌液接種于 500 ml 的裝有 200 ml液體蘇通培養(yǎng)基的三角瓶中，100 ～ 200 r/min，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至第 7 天，將結(jié)核分枝桿菌菌液收集到離心桶內(nèi)，4 ℃，8000 r/min，離心 30 min，離心結(jié)束后棄去菌體，收集培養(yǎng)上清。將培養(yǎng)上清過 0.22 μm 濾膜除菌。將除菌過濾后的培養(yǎng)上清置于超濾離心管中進行超濾離心，4 ℃，4000 r/min，控制離心時間使培養(yǎng)上清濃縮 10 倍；然后補加磷酸鹽緩沖液至初始體積，相同條件再次進行超濾離心濃縮，步驟重復 3 次，將培養(yǎng)上清中的培養(yǎng)基成分去除，置換成磷酸鹽緩沖液；最后濃縮得到的蛋白即為早期培養(yǎng)濾液蛋白，以 Lowery 法測蛋白濃度進行定量。

1.2.2 早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于結(jié)核病的輔助診斷 實驗對象為臨床確診的結(jié)核病患者（簡稱患者）和無結(jié)核接觸史且接種過卡介苗（BCG）的健康志愿者（簡稱健康接種者），其中患者 24 例，來源于北京市結(jié)核病控制研究所；健康接種者 20 例，來源于北京市結(jié)核病控制研究所和本室工作人員。分別取肝素鈉抗凝靜脈血 5 ～10 ml，應用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，單個核細胞經(jīng)過計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為 2.5 × 106個/ml。在已經(jīng)包被 INF-γ 單抗的 96 孔板上，分別加入 50 μl 培養(yǎng)基為陰性對照，50 μl 植物血凝素（PHA）為陽性對照，50 μl 不同濃度（分別為 0.2、1 和 5 μg/ml）的早期培養(yǎng)濾液蛋白為測試孔。然后在每孔中加入 100 μl 細胞懸液。在 5%CO2，37 ℃ 條件下共同孵育 16 ～ 20 h。孵育結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，用 200 μl PBS 緩沖液重復洗板 4 次。每孔加入 50 μl標記抗體工作液，置 2 ～ 8 ℃ 孵育 60 min。孵育結(jié)束后棄去反應孔內(nèi)液體，用 200 μl PBS 緩沖液重復洗板 4 次。每孔加入顯色底物溶液 50 μl，在室溫中反應 5 ～ 10 min 后形成斑點。用實驗用水洗滌各孔終止反應。以 ELISPOT 讀板儀計數(shù)各孔斑點個數(shù)以進行診斷，其中陽性判斷標準為：實驗孔斑點數(shù) － 陰性孔斑點數(shù) ≥ 6 個；陰性判斷標準為：實驗孔斑點數(shù) － 陰性孔斑點數(shù) ＜ 6 個。

1.2.3 早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于篩查結(jié)核桿菌潛伏感染人群 實驗對象為 PPD 皮試強陽性者[即皮試后 72 h 局部硬結(jié)直徑 ≥ 15 mm 和（或）伴有水皰、壞死者]，男女均有，共 32 例。分別以早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法和市售 T-SPOT.TB 試劑盒進行體外診斷。早期培養(yǎng)濾液蛋白工作濃度為 5 μg/ml，具體操作步驟同 1.2.2。T-SPOT.TB 試劑盒操作步驟為：96 孔板中分別加入 50 μl 培養(yǎng)基為陰性對照，50 μl 植物血凝素（PHA）為陽性對照，分別以 50 μl 結(jié)核分枝桿菌特異性ESAT6 和 CFP10 肽段庫作為刺激源，然后在每孔中加入100 μl 細胞懸液。在 5% CO2，37 ℃ 條件下共同孵育 16 ～20 h。孵育結(jié)束后 PBS 洗板 4 次，加入 50 μl 堿性磷酸酶標記的二抗，2 ～ 8 ℃ 孵育 1 h。PBS 洗板 4 次。每孔加入顯色底物液 BCIP / NBTPLUS，室溫中靜置 7 min，去離子水終止反應。斑點計數(shù)和判斷標準同早期培養(yǎng)濾液蛋白IFN-γ-ELISPOT 方法。

2 結(jié)果

2.1 早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于結(jié)核病輔助診斷的靈敏度和特異性分析

實驗對象為健康志愿者 20 例，結(jié)核患者 24 例。以不同濃度早期培養(yǎng)濾液蛋白為刺激源對以上志愿者和患者進行體外 IFN-γ-ELISPOT 診斷，實驗數(shù)據(jù)見圖 1。以健康志愿者結(jié)果分析不同濃度早期培養(yǎng)濾液蛋白的診斷特異性，以患者結(jié)果分析不同濃度早期培養(yǎng)濾液蛋白的診斷敏感性（表 1）。

根據(jù)不同濃度的早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT診斷結(jié)果，選取敏感性和特異性均較高的診斷組，確定早期培養(yǎng)濾液蛋白的最適工作濃度為 5 μg/ml，建立標準化的早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 診斷方法。

2.2 早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法用于篩查結(jié)核桿菌潛伏感染人群的研究

結(jié)核桿菌潛伏感染人群尚無診斷金標準，通常將 PPD皮試結(jié)果呈強陽性者認為是結(jié)核桿菌潛伏感染人群。實驗選取 PPD 皮試強陽性者共 32 例，以 5 μg/ml早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法和 T-SPOT.TB 試劑盒分別對此部分人群進行體外診斷，分析早期培養(yǎng)濾液蛋白IFN-γ-ELISPOT 方法與 PPD 皮試方法的一致性，并同時與T-SPOT.TB 結(jié)果進行比較。實驗結(jié)果見表 2。

圖 1 不同濃度早期培養(yǎng)濾液蛋白在健康志愿者（A）和結(jié)核病患者（B）中的試驗孔斑點數(shù)結(jié)果

3 討論

我國結(jié)核病疫情嚴重，而潛伏性感染人群大、范圍廣又是導致結(jié)核病暴發(fā)的一個重要因素。如果能全面有效地診斷出結(jié)核桿菌潛伏感染人群并能在感染的早期進行治療和干預，就可以有效預防結(jié)核病的發(fā)生。但結(jié)核桿菌潛伏感染人群的診斷尚無金標準[3]，目前 PPD 皮試試驗是診斷結(jié)核桿菌潛伏感染人群的常用方法，但這一方法有一定的缺陷性。由于試驗所用 PPD 抗原為結(jié)核分枝桿菌、非致病性分枝桿菌和卡介苗（BCG）所共有，具有交叉反應，故診斷特異性較差[4-5]。因此，尋找合適的結(jié)核桿菌特異性抗原及新的診斷技術，對像中國這樣普遍接種卡介苗的國家將十分必要，也尤為重要。

IFN-γ-ELISPOT 方法是近年來發(fā)展起來的用于結(jié)核桿菌感染的體外診斷方法。此方法結(jié)合特異性結(jié)核抗原即能發(fā)展成結(jié)核病輔助診斷和潛伏感染人群篩查的具有較好敏感性和特異性的診斷方法。

單一的抗原缺乏良好的診斷敏感性，具有結(jié)核桿菌特異性的復合抗原將是理想的抗原選擇。文獻報道顯示：結(jié)核桿菌早期培養(yǎng)濾液蛋白可能存在 ESAT6、MPT64 和 Ag85b等蛋白，這些分泌性蛋白抗原均是記憶性免疫 CD4+T 細胞的靶分子，能夠體外誘導 T 淋巴細胞分泌 INF-γ，是理想的 IFN-γ-ELISPOT 診斷方法的體外刺激源。實驗制備早期培養(yǎng)濾液蛋白，以其作為刺激源，結(jié)合 IFN-γ-ELISPOT 方法，建立早期培養(yǎng)濾液蛋白-IFN-γ-ELISPOT 診斷技術。實驗結(jié)果顯示優(yōu)化后的該方法在結(jié)核病人中的診斷敏感性為100%，在健康志愿者中的診斷特異性為 90%，具有很好的診斷效能。

目前國際上診斷結(jié)核桿菌潛伏感染人群較為常用的是TB-SPOT.TB 試劑盒[6]，該試劑盒是應用 ELISPOT 技術定量檢測分泌 γ 干擾素的效應性 T 細胞來診斷結(jié)核桿菌感染。該試劑盒選用了只存在于結(jié)核分枝桿菌基因組，但在卡介苗和非致病性分枝桿菌中普遍缺失的 RD1 區(qū)編碼蛋白作為特異性的 T 細胞抗原?？乖捎玫氖莻鹘y(tǒng)的合成肽加載刺激的方法，即使用來源于特異性抗原的相互重疊的合成肽混合物作為檢測樣本的刺激源，所用的特異性抗原主要是結(jié)核分枝桿菌早期分泌蛋白中的 ESAT-6 和 CFP-10。但此方法也有其局限性，即混合多肽池并不能包括結(jié)核分枝桿菌全部的表位肽，在檢測中仍存在缺失現(xiàn)象，會造成檢測遺漏，產(chǎn)生假陰性，特別對于我國這樣一個疫情嚴重、潛伏性感染范圍大的情況，能夠盡可能全面地檢出潛伏性感染者有其重要的現(xiàn)實意義，而 TB-SPOT.TB 試劑盒在這一方面存在局限。

實驗比較早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 和T-SPOT.TB 試劑盒兩種方法與 PPD 皮試結(jié)果的一致性。在32 例 PPD 皮試強陽性人群中分別應用這兩種方法進行體外診斷，結(jié)果顯示：早期濾液蛋白-INF-γ-ELISPOT 方法與PPD皮試強陽性結(jié)果具有很高的一致性（93.7%），而現(xiàn)有的 T-SPOT.TB 試劑盒一致性僅為 50%。

早期培養(yǎng)濾液蛋白 IFN-γ-ELISPOT 方法與 PPD 皮試強陽性結(jié)果一致性高，表明其能夠比市售 T-SPOT.TB 試劑盒更廣泛地檢測出結(jié)核桿菌潛伏感染人群。其同時與 PPD比較，可能還具有較高的檢測特異性將能夠保證部分卡介苗接種人群造成的強陽性反應者被剔除。在我國這樣高感染、高發(fā)病且普遍接種卡介苗的國家，早期培養(yǎng)濾液蛋白IFN-γ-ELISPOT 方法在結(jié)核桿菌潛伏感染人群中的篩查較其他方法具有重要的現(xiàn)實意義和廣闊的應用前景。

[1]Andersen P, Doherty TM, Pai M, et al.The prognosis of latent tuberculosis: can disease be predicted? Trends Mol Med, 2007,13(5):175-182.

[2]Demissie A, Ravn P, Olobo J, et al.T-Cell recognition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate Fractions in tuberculosis patients and their household contacts.Infect Immun, 1999, 67(11):5967-5971.

[3]Lalvani A, Pareek M.A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection.Br Med Bull, 2010, 93:69-84.

[4]Brock I, Welding K, Lillebaek T, et al.Comparison of tuberculin skin test and new specific blood test in tuberculosis contacts.Am J Respir Crit Care Med, 2004, 170(1):65-69.

[5]Ewer K, Deeks J, Alvarez L, et al.Comparison of T-cell-based assay with tuberculin skin test for diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection in a school tuberculosis outbreak.Lancet, 2003, 361(9364):1168-1173.

[6]Pai M, Kalantri S, Dheda K.New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: part I.Latent tuberculosis.Expert Rev Mol Diagn, 2006, 6(3):413-422.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.014

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項（2009ZX1004-803）

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院細菌一室

陳保文，Email：bwnchen@yahoo.com.cn

2012-02-24

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