趙小波 , 劉 峰 單體鋒 逄少軍

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所海藻種質(zhì)庫(kù), 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

大型海藻(Macroalgae)依據(jù)光合色素的不同而分為紅藻(Rhodophyta), 褐藻(Phaeophyta)和綠藻(Chlorophyta), 它們是海洋環(huán)境中重要的初級(jí)生產(chǎn)者。大型海藻可以直接為人類提供食物, 也可以作為飼料轉(zhuǎn)化為動(dòng)物性蛋白。同時(shí), 大型海藻還是重要的藥源生物。近年, 我國(guó)科學(xué)家僅利用海帶就成功得開(kāi)發(fā)出了PSS、腎?？岛透侍酋サ榷喾N藥物。此外, 由于大型海藻是自養(yǎng)生物, 對(duì)改善近岸富營(yíng)養(yǎng)化水域有重要作用。我國(guó)已經(jīng)形成了大型海藻育苗、栽培、加工到精加工的產(chǎn)業(yè)集群[1]。據(jù)世界糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì),2006年中國(guó)海藻養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)值為52億美元, 居世界首位[2]。2008年, 我國(guó)大型海藻養(yǎng)殖產(chǎn)量為150.3萬(wàn)噸 (干質(zhì)量), 占我國(guó)海水養(yǎng)殖總量的11.5%,養(yǎng)殖面積9.4萬(wàn)ha, 年產(chǎn)值近400億元 , 提供近100萬(wàn)勞動(dòng)力就業(yè)崗位, 具有重要的社會(huì)經(jīng)濟(jì)意義[3]。

大型海藻產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展需要發(fā)掘更多的新海藻種質(zhì)資源, 包括沒(méi)有被認(rèn)識(shí)的新海藻種類和已經(jīng)認(rèn)識(shí)但是沒(méi)有進(jìn)行深層次開(kāi)發(fā)和利用的物種。這些工作的基礎(chǔ)就是科學(xué)、準(zhǔn)確地完成對(duì)這些活體資源的分類鑒定。傳統(tǒng)上藻類分類學(xué)家主要以藻體形態(tài)特征, 顯微結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)作為分類依據(jù)。但是, 傳統(tǒng)分類學(xué)方法存在較大的弊端: 大型海藻的形態(tài)特征易受環(huán)境因素的影響, 發(fā)生改變; 并且在物種水平上, 有時(shí)形態(tài)特征差異極其微弱, 僅憑肉眼鑒定十分困難或者容易出錯(cuò)[4]; 相當(dāng)數(shù)量大型海藻生活史研究的缺乏, 也加大了物種鑒定的難度。此外, 傳統(tǒng)分類學(xué)的鑒定極其依賴鑒定者的經(jīng)驗(yàn), 這也限制了該方法的應(yīng)用。最近10年, 分子系統(tǒng)學(xué)發(fā)展迅速, 利用DNA數(shù)據(jù)探討生物的系統(tǒng)發(fā)育已經(jīng)成為研究者普遍接受和采用的手段。加拿大科學(xué)家Hebert于2003年明確提出了 DNA條碼技術(shù)(DNA barcoding)的概念, 用于動(dòng)物學(xué)的分類研究[5-6]。隨后這一技術(shù)迅速推廣到生物學(xué)其他領(lǐng)域, 其中包括大型海藻的分類鑒定。由于該技術(shù)具有利用生物種群中的某些遺傳保守性很強(qiáng)的DNA片段進(jìn)行物種鑒定和親緣關(guān)系的定位, 了解其分支來(lái)源, 甚至可以預(yù)知其進(jìn)化方向等諸多用途, 因而近年來(lái)迅速成為生物分類學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。本文作者根據(jù)能夠收集到的已知文獻(xiàn), 概述了DNA條碼技術(shù)的主要原理特點(diǎn)和在大型海藻分類鑒定上的應(yīng)用狀況以及目前存在的問(wèn)題, 并結(jié)合作者的實(shí)際工作特點(diǎn)展望了該技術(shù)應(yīng)用前景。

1 DNA條碼技術(shù)主要原理與特點(diǎn)

DNA條碼技術(shù)(DNA barcoding)是利用標(biāo)準(zhǔn)的、變異度足夠的、相對(duì)較短且易擴(kuò)增的DNA片段在物種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而建立的一種生物物種識(shí)別系統(tǒng), 它可以對(duì)物種進(jìn)行快速準(zhǔn)確的自動(dòng)鑒定[7]。利用DNA條碼技術(shù)可以克服傳統(tǒng)分類學(xué)的許多缺陷, 例如對(duì)于經(jīng)驗(yàn)的依賴, 對(duì)各種形態(tài)特征齊全的標(biāo)本的依賴等。同時(shí), DNA條碼技術(shù)在快速檢測(cè)入侵種,發(fā)現(xiàn)隱藏種,調(diào)整已有物種分類地位方面取得了重大進(jìn)展?，F(xiàn)在, 在DNA barcoding中心數(shù)據(jù)倉(cāng)庫(kù)-《生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)》(BOLD)數(shù)據(jù)庫(kù)中, 已經(jīng)有超過(guò)30萬(wàn)個(gè)條形碼序列。研究人員已經(jīng)對(duì)3萬(wàn)多個(gè)物種進(jìn)行條形碼描繪, 其中多數(shù)是魚類、鳥(niǎo)類和昆蟲類。它具有如下特點(diǎn): (1)不受發(fā)育階段的影響。同種生物的 DNA序列信息在不同的生命階段是不變的。(2)準(zhǔn)確性高。特定的物種具有特定的DNA序列信息, 而形態(tài)學(xué)鑒別特征會(huì)因環(huán)境變化等因素干擾產(chǎn)生誤差。(3)通過(guò)建立DNA條碼技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù), 可一次性快速鑒定大量樣本。分類學(xué)家將新的研究成果不斷地加入數(shù)據(jù)庫(kù), 成為永久性資料。(4)不受物種限制。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)DNA條碼技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)建立之后,可使各種物種的分類鑒定不限于原產(chǎn)物種、瀕危物種或入侵種等。(5)可簡(jiǎn)化鑒定過(guò)程。該技術(shù)是可機(jī)械重復(fù)的, 只要設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方案, 經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)的研究者即可操作[8-9]。

在一系列的研究中[4-6], COI (線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基 I)基因被廣泛推薦作為標(biāo)準(zhǔn)的 DNA barcoding。原因在于 COI基因能夠保證足夠變異的同時(shí)又相對(duì)容易被通用引物擴(kuò)增,而且目前研究結(jié)果表明, 其DNA序列本身很少存在插入和缺失。同時(shí),它還擁有蛋白編碼基因所共有的特征, 即密碼子第3位堿基不受自然選擇壓力的影響, 可以自由變異[10]。近年來(lái), 其他序列, 如核糖體 RNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS), 核酮糖 1,5-二磷酸羧化/氧化酶大亞基基因(rbcL), UPA (universal plastid amplicon, domain V of the 23S rDNA)等也被廣泛應(yīng)用于物種鑒定。

2 DNA條形碼技術(shù)在大型海藻分類鑒定上的應(yīng)用

2.1 DNA條形碼技術(shù)在紅藻研究上的進(jìn)展

加拿大科學(xué)家Saunders調(diào)查了6目15科的紅藻樣品, 認(rèn)為COI基因在紅藻中約為710個(gè)堿基對(duì),種內(nèi)基因變化為0～0.3%, 種間則達(dá)到了4.5%～13.6%。雖然Mazzaella linearis與M. splendens之間只有0.8%～1.2%的差異,Dilsea carnosa與D. integra之間只有 1.1%的差異, 但是分子生物學(xué)比對(duì)結(jié)果卻能正確地區(qū)分不同的種, 與經(jīng)典形態(tài)學(xué)的結(jié)果一致, 因此COI基因可用于紅藻種水平的分類鑒定[11]。Robba等研究了6目48個(gè)紅藻樣品, 得出了類似的結(jié)論[4]。

但是 COI基因在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的缺陷,即缺乏通用引物, 這一點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)室的研究以及相關(guān)文獻(xiàn)中均得到證實(shí)[12-14]。為了提高使用 DNA序列鑒別物種的可靠性與可行性, 需要考慮使用其他序列作為COI的補(bǔ)充[15]。Goff等[16-19]認(rèn)為已在陸地植物鑒別上廣泛使用的 ITS序列可以用來(lái)識(shí)別紅藻類群。Hu等[20]分析了12屬96種的紅藻ITS序列, 發(fā)現(xiàn)其中95%的ITS序列長(zhǎng)度為600～1200bp,并且與對(duì)應(yīng)種屬的 COI基因序列比對(duì), 進(jìn)而認(rèn)為 ITS序列可以作為 COI的有力補(bǔ)充, 可在種的水平對(duì)紅藻進(jìn)行分類鑒定。但是也有部分科學(xué)家認(rèn)為 ITS序列不適宜作為鑒別紅藻物種的分子生物學(xué)手段[21-22]。例如Saunders[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn), 認(rèn)為ITS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤。本實(shí)驗(yàn)室在研究中也發(fā)現(xiàn),紅藻的ITS序列具有多態(tài)性, 會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析, 因此不推薦ITS序列作為紅藻的DNA Barcoding(未發(fā)表)。此外, UPA 序列也開(kāi)始廣泛的測(cè)試, 以檢測(cè)其在紅藻分類鑒定中的作用。一系列的研究表明, UPA序列具有在物種水平上區(qū)分紅藻的潛力[23-25]。本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果也表明, UPA 序列具備區(qū)分紅藻物種的潛力, 但是相對(duì)COI基因, UPA變異度較低, 是否可以區(qū)分親緣關(guān)系較近的物種需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

紅藻DNA條碼技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也取得了一定的進(jìn)展。江蘺科海藻是世界上主要的瓊膠來(lái)源[26-27],對(duì)于它的研究不僅具備極高的應(yīng)用價(jià)值, 也具備很高的生態(tài)價(jià)值; 傳統(tǒng)上, 江蘺科在加拿大只有3個(gè)種的分布[28]。Saunders[29]檢測(cè)了加拿大沿海諸省的151個(gè)樣品的COI基因, 發(fā)現(xiàn)除傳統(tǒng)的3個(gè)種之外,又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)“新”種。進(jìn)一步的研究認(rèn)為該種與美國(guó)得克薩斯州收集到的樣品具有相似的 COI基因, 從而 Saunders提出了生物入侵的問(wèn)題。此外, 使用DNA條碼技術(shù)還可以幫助研究人員發(fā)現(xiàn)隱藏種。Robba利用 COI基因序列比對(duì), 在Bangia fuscopurpurea,Corallina officinalis均發(fā)現(xiàn)了隱藏種, 樣品之間具有28～52bp的差異[4]。Milstein[13]在研究紫菜的基因條碼時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Porphyra acanthophora的隱藏種, 樣品之間 COI基因序列的差異達(dá)到了11.6%。

2.2 在褐藻研究方面的進(jìn)展

加拿大水域的墨角藻屬(Fucus),傳統(tǒng)上以棲息地,葉狀體的形態(tài), 繁殖特征為分類依據(jù)。但在實(shí)際應(yīng)用中, 卻面臨許多困難[30]。為了解決這一問(wèn)題, Kucera等[31]提取了 125個(gè)樣品 COI基因的序列, 發(fā)現(xiàn)種內(nèi)的差異為 0.3%, 與紅藻及其他許多物種相一致; 種間水平上(5～23個(gè)堿基不同), 卻要低于紅藻的水平(大于30個(gè)堿基)。但是與經(jīng)典形態(tài)學(xué)分類法比較, 仍可以將墨角藻屬的不同種鑒別出。此外, DNA條碼技術(shù)還可以糾正傳統(tǒng)分類學(xué)的錯(cuò)誤。例如, Coyer等[32]使用COI基因?qū)幽么竽窃鍖龠M(jìn)行了分子生物學(xué)研究, 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, Coyer等建議將Fucu distichus和F.gardneri歸為同一個(gè)種, 并且將加拿大的墨角藻歸為 4個(gè)種, 除前述之外, 尚有太平洋的F.spiralis,大西洋的F.vesiculosus和F.serratus。

翅藻屬(Alaria)由于易受環(huán)境因素的影響, 導(dǎo)致在相似環(huán)境的分布區(qū)內(nèi), 同屬各種之間形態(tài)學(xué)特征極為相似, 有時(shí)難以區(qū)分[33-34]。Lane[35]研究了東北太平洋54個(gè)翅藻屬樣品的COI基因、ITS序列和rbcL基因后, 提出 COI基因可以將翅藻屬區(qū)分到種的水平, 進(jìn)而提出可將該基因應(yīng)用于褐藻整體的分類鑒定的理論; ITS序列進(jìn)化速率過(guò)快, 不適宜作為鑒定翅藻屬內(nèi)種水平的分子生物工具; rbcL基因由于保守型過(guò)強(qiáng), 不能將翅藻屬區(qū)分到種的水平。此外, 他還結(jié)合形態(tài)學(xué), 生態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)的方法, 提出將Alaria fi stulosa從翅藻屬內(nèi)獨(dú)立出來(lái), 成為翅藻科內(nèi)的一個(gè)新屬。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證COI基因在褐藻分類鑒定方面的作用, McDevit研究了褐藻 9科 106個(gè)樣品(包括Alariaceae、Chordariaceae、Costariaceae、Dictyotaceae、Laminariaceae、Lessoniaceae、Phyllariaceae、Sargassaceae 和 Scytosiphonaceae)的 COI基因序列,發(fā)現(xiàn)種內(nèi)變化為 0～0.46%, 種間變化為 3.04%～10.80%, 可以將研究的樣品區(qū)分到種的水平。同時(shí),他也做了相關(guān)ITS序列的研究, 發(fā)現(xiàn)種內(nèi)變異為0～1%, 種間變異為 4.6%～6.3%, 其遺傳分析時(shí)具有與COI基因相類似的結(jié)果, 也可以作為分類鑒定的手段[36]。這一點(diǎn)與 Lane等不同。但是相對(duì)于紅藻的DNA條碼技術(shù), 褐藻領(lǐng)域相關(guān)方面的研究尚顯薄弱,需要進(jìn)一步的發(fā)展。

2.3 DNA條形碼技術(shù)在綠藻領(lǐng)域的進(jìn)展

黃海海域近年來(lái)發(fā)生大規(guī)模綠藻暴發(fā)現(xiàn)象[37],導(dǎo)致了海洋生態(tài)問(wèn)題以及社會(huì)問(wèn)題[38]。Liu等采集發(fā)時(shí)的樣品, 結(jié)合形態(tài)學(xué)方法, 研究了樣品的 ITS序列,發(fā)現(xiàn) 2008年在青島海域發(fā)生的綠藻暴發(fā)現(xiàn)象是由Ulva prolifera引起的, 同時(shí)發(fā)現(xiàn)該種并非青島原產(chǎn),為綠藻大規(guī)模暴發(fā)的預(yù)防與溯源提供了科學(xué)依據(jù)[39-40]。Wang等[41]使用 ITS和 rbcL序列研究了黃海兩側(cè)石莼屬(Ulva)與滸苔屬(Enteromorpha)的分布,共計(jì)發(fā)現(xiàn)5種滸苔屬, 3種石莼屬, 并顯示了滸苔屬和石莼屬在黃海兩側(cè)的分布區(qū)域。張曉雯等[42]對(duì)2008年黃海采集的22個(gè)滸苔以及青島海域采集的樣品利用ITS和5.8S序列進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)完全一致, 應(yīng)成琦等[43]對(duì) 2008年山東青島, 江蘇如東, 江蘇連云港海區(qū)采集的樣品做了ITS以及18S序列分析, 結(jié)果表明, 3個(gè)海區(qū)樣品的ITS以及18S序列完全一致。

Stam等使用ITS 基因研究了美國(guó)佛羅里達(dá), 美屬維爾京群島, 巴哈馬等地出售的蕨藻, 在所有256個(gè)樣品中共發(fā)現(xiàn) 14個(gè)種, 其中總狀蕨藻(Caulerpa racemosa)最為常見(jiàn), 其次為棒葉蕨藻(Caulerpa sertularioides)等。Stam[44]指出, 為了監(jiān)測(cè)蕨藻的生物入侵, 必須使用 ITS 序列, 因?yàn)槭褂眯螒B(tài)學(xué)手段來(lái)鑒別蕨藻是不可靠的, 有超過(guò) 12%的錯(cuò)誤率。

3 DNA條形碼技術(shù)的爭(zhēng)議及前景

經(jīng)過(guò)近幾年的發(fā)展, DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)取得了較大進(jìn)步, 但是, 在得到了許多生物學(xué)家的支持也有部分學(xué)者對(duì)此持懷疑態(tài)度, 對(duì)該技術(shù)的價(jià)值存在一些爭(zhēng)議, 認(rèn)為這個(gè)新技術(shù)會(huì)削弱或者取代以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)分類方法[45-46]。

此外, 大型海藻DNA條碼技術(shù)的選擇尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。分類學(xué)家希望能應(yīng)用一小段DNA序列就可以區(qū)別所有大型海藻。但根據(jù)目前的研究, 僅僅運(yùn)用COI這一基因來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)所有海藻種的鑒定仍然存在很大的不足。例如, Hana認(rèn)為COI不適宜在綠藻鑒定中使用(未發(fā)表), COI基因也尚未發(fā)現(xiàn)合適的通用引物; 傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)還未能達(dá)到有效的結(jié)合。DNA條碼技術(shù)必須依賴傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué),在條碼技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)建立之前, 研究必須建立在形態(tài)分類學(xué)研究的基礎(chǔ)上; 建庫(kù)后, 驗(yàn)證要以形態(tài)分類學(xué)結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)[8]; Saunders認(rèn)為現(xiàn)在關(guān)于大型海藻DNA條碼技術(shù)的研究尚淺, 需要進(jìn)一步加深[11]。

目前, 對(duì)生物資源, 特別是野生資源的研究與利用已經(jīng)成為國(guó)家可持續(xù)發(fā)展能力的重要體現(xiàn), 并且, 在很大程度上已成為一個(gè)戰(zhàn)略問(wèn)題。此外, 對(duì)瀕危物種和外來(lái)物種入侵現(xiàn)象進(jìn)行評(píng)估、監(jiān)測(cè)和預(yù)警也需要快速而準(zhǔn)確地鑒定物種[9]。當(dāng)前科學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 特別是分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展與有機(jī)結(jié)合, 為建立全面準(zhǔn)確的DNA條碼技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)提供了必要的基礎(chǔ)。國(guó)家目前已啟動(dòng)或正在醞釀一些項(xiàng)目用來(lái)將 DNA條碼技術(shù)應(yīng)用到物種分類中,這不僅反映了國(guó)際生物分類學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)發(fā)展的方向,同時(shí)也賦予了在中國(guó)開(kāi)展此類研究的良好時(shí)機(jī)。坐落在山東青島的中國(guó)科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫(kù)海藻種質(zhì)庫(kù)(URL: www.mbccc.ac.cn)目前在廣泛收集和活體保存我國(guó)自有海藻種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上, 正致力于建立相對(duì)完整的DNA條碼技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù), 用來(lái)識(shí)別我國(guó)18000km海岸線上自然生長(zhǎng)的數(shù)以千計(jì)的海藻物種, 并且已在基礎(chǔ)理論與實(shí)踐上取得了一定的進(jìn)展。相信隨著時(shí)間的推移, 更多工作的開(kāi)展, 能夠被我們利用的基因條碼信息會(huì)越來(lái)越多。

總之, DNA條碼技術(shù)作為一個(gè)新的生物理論,將產(chǎn)生重大的科學(xué)影響和經(jīng)濟(jì)意義, 同時(shí)也應(yīng)引起國(guó)內(nèi)相關(guān)科學(xué)工作者更多的關(guān)注[10]。DNA條碼技術(shù)應(yīng)該被更好、更廣泛的應(yīng)用于大型海藻的進(jìn)化來(lái)源、進(jìn)化趨勢(shì)、物種演變、分類學(xué)等方面的研究。

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