劉彬，可金星，蔡紹皙，李校堃，張路，陳文琦1,,5，張耀光

1 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400715

2 第三軍醫(yī)大學中心實驗室，重慶 400030

3 重慶大學生物工程學院，重慶 400030

4 吉林農業(yè)大學 生物反應器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長春 130118

5 西南大學生命科學學院，重慶 400715

周圍神經缺損替代修復是一個復雜且難度較高的問題，生物組織工程支架是解決這一難題的有效途徑。材料問題一直是神經支架所面臨的重要問題之一，很多材料都被應用這一領域的研究中[1-8]。單一材料在體現其優(yōu)勢的同時，通常也體現出一些缺陷，因此采用多種材料制備復合材料作為神經支架以促進周圍神經損傷修復，是目前普遍認可的方法。新鮮豬皮中水分含量為55.5%，脂肪含量為13.56%，豬皮中的膠原含量約為24.35%，其余部分主要為細胞內容物[9]。以豬皮為原料制備細胞外基質 (ECM) 的實質是去除脂肪和具有免疫原性的細胞內容物。豬皮來源的ECM主要由膠原構成，除此之外還含有層粘連蛋白、纖維結合蛋白等有益于神經再生的物質，具有良好的生物相容性[1]。其中，膠原為三股螺旋結構，α1和α2鏈的分子量約為100 kDa，β鏈的分子量約為200 kDa，變性溫度為37.5 ℃。膠原分子主要包含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸，不含色氨酸和胱氨酸[9-10]。豬皮在厚度及其面積方面的優(yōu)勢決定了豬皮來源的ECM更易于加工成神經支架所需要的形態(tài)。NGF在神經損傷修復中的作用得到了廣泛的認同，但是，NGF緩釋體系的合理性直接決定了NGF功能的發(fā)揮[1]。在以豬皮來源的ECM制備對NGF具有緩釋功能的神經支架的過程中，需要一種包封劑。PLGA良好的生物相容性及其生物可降解性等性質，都表明它適合作為這種包封劑。PLGA在體內降解過程中，會釋放弱酸性物質，從而為組織環(huán)境pH的穩(wěn)定造成一定的壓力[11]，本研究擬采用一種弱堿性物質，即賴氨酸[12-13]來克服這一問題。

本研究以豬皮為原料制備 ECM，用 PLGA將NGF和賴氨酸復合在ECM上，以構建一種對NGF具有緩釋功能，并可以在一定程度上中和PLGA酸性降解產物的復合材料。通過形態(tài)學觀察、力學測試、降解試驗、細胞學試驗，在體外評價其作為神經支架的可行性。由于本材料僅供體外測試使用，故其形態(tài)未與周圍神經的幾何形態(tài)相匹配。

1 材料與方法

1.1 豬皮來源ECM的制備與觀測

取豬肩背部新鮮豬皮，去毛，溫水清洗，切割成條狀 (2 mm×2 mm×100 mm)，用NaOH溶液脫脂，用NaCl進行高滲透壓處理，用純凈水進行低滲透壓處理，用胰蛋白酶 (Sigma公司)破壞細胞成分、細胞連接，疏松膠原，用5 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) +2%TritonX- 100中在37 ℃下振蕩浸泡3 d，室溫下用清水沖洗2 d，用Trix-100 (Sigma公司) 進行去垢處理，純凈水漂洗；用冷凍干燥機 (Flexi-Dry μP，FTSSYSTEM，USA) 脫水；分別進行掃描電子顯微鏡 (AMRAY 1000B，USA) 和 HE染色觀測去細胞效果以及內部形態(tài)[14]。

1.2 NGF明膠微球的制備

在明膠 (Bloom strength，225；pI：4.7；Sigma)水溶液中加入NGF (?-NGF，Human，Sigma)，加入植物油 (37 ℃) 乳化，冷凍到?20 ℃，在冷凍離心機中分離，沉淀物用丙酮洗滌，除去植物油和水，冷凍干燥，篩分備用 (400目)[15-20]。

1.3 神經支架的制備

將NGF明膠微球、賴氨酸、豬皮來源ECM置于3% (W/V) PLGA (8020 mole ratio of lactide to glycolide；Sigma) 的二氯甲烷溶液中，振蕩混合后，負壓抽干。

1.4 內部形態(tài)觀察及孔隙率測定

用掃描電子顯微鏡 (AMRAY 1000B，USA)觀察神經支架的表面及斷面的形態(tài)；用文獻報道的方法測定孔隙率和密度[21]。

1.5 力學測試

用材料力學測試機 (INSTRON 1011，USA)檢測神經支架的力學性質 (加載速度為10 mm/min)。

1.6 體外降解測試

取神經支架 (300±1) mg (以豬皮來源ECM和 PLGA為對照)，置于安培瓶中，分別加入10 mL三蒸水或PBS (Sigma公司)，置于搖床(50 r/min) 在生化培養(yǎng)箱 (37 ℃) 中持續(xù)處理8周，期間不更換降解液，每周取樣1次。用pH計 (DELTA320) 在各時間點檢測降解液pH值。在前4周分別稱量各樣品的濕重和干重 (經冷凍干燥)，稱重后將樣品重新放回原降解液中。對于進行SEM觀察的樣品做相同的處理。

1.7 對NGF的持續(xù)釋放作用

取50 mg神經支架，加入10 mL PBS，置于搖床 (40 r/min) 在生化培養(yǎng)箱 (37 ℃) 中持續(xù)處理30 d每次取樣1 mL，同時回加1 mL新鮮的PBS。期間，在起始12 h中，每間隔2 h取樣1次，在此后的2 d內，每12 h取樣1次，之后，每天取樣1次。對各樣品進行?70 ℃保存。待全部取樣完成后，統(tǒng)一用β-NGF (human) ELISA kit (Sigma) (按試劑盒使用說明書) 對各樣品進行處理。神經支架對NGF的累計釋放率的計算公式為：

1.8 雪旺氏細胞在神經支架上的粘附與增殖

雪旺氏細胞的分離、培養(yǎng)與純化，及 MTT法均參照文獻報道的方法進行[22-23]。在神經支架與雪旺氏細胞共培養(yǎng)15 d后，取出材料進行SEM觀察。

2 結果

2.1 豬皮來源ECM觀察

蘇木精-伊紅 (HE) 染色，是一種傳統(tǒng)而經典的組織學方法，可以將細胞核物質染成紫色，將其余物質染成粉紅色。從圖1可以看出，新鮮豬皮 (圖1A) 相對致密，其中零星分布著一些細胞，ECM (圖1B) 較為疏松，無細胞。這可以說明本研究中所使用的 ECM 實現了去細胞的目的。SEM觀察結果顯示，與新鮮豬皮 (圖1C) 相比，ECM (圖1D) 中膠原纖維的排列較為疏松，纖維的直徑為1~10 μm左右，纖維間縫隙的寬度為5~50 μm左右，這就為制備內部具有相互聯(lián)通的蜂窩狀結構的神經支架提供了充分的前提條件，同時也為NGF 明膠微球進入其內部以構建NGF緩釋體系創(chuàng)造了條件。

2.2 神經支架的形態(tài)和結構

本神經支架的孔隙率為 68.3%~81.2%，密度為0.62~0.68 g/cm3?？障堵适巧窠浿Ъ艿闹匾笜酥?。但是并不能直接地用于評價神經支架的優(yōu)劣。因為支架內部孔隙的大小、相互間的連通性、均質程度，才與雪旺氏細胞和軸突是否能夠順利地在支架內部穿行和進行物質交換直接相關。同時，在支架的降解過程中，以及在巨噬細胞的吞噬過程中，支架內部會有新的空隙形成。再者，過高的孔隙率意味著支架質地過于疏松，會導致質地脆弱，難以耐受移植過程中的手術操作，以及術后的組織壓迫和牽拉。所以，孔隙率的指標需要與支架的力學性質及內部結構相結合，以評價神經支架形態(tài)的合理性。

SEM觀察顯示，PLGA在神經支架表面 (圖2A) 形成膜狀結構，同時在表面形成一系列分布較為均勻的直徑介于1~5 μm的孔隙。這些孔隙主要是在材料制備過程中，在負壓作用下由溶質揮發(fā)所形成的。這種尺度的孔隙允許神經支架內部橫向就近與組織環(huán)境進行物質交換，但細胞無法通過。這種結構或許可以改善神經損傷修復中，移植體內部與組織環(huán)境間的物質交換問題，這無疑會有益于軸突的再生。細胞無法在這些孔隙中通過，對軸突的有序生長是有益的。因此本神經支架的表面形態(tài)符合神經再生的要求。

神經支架的斷面 (圖2B) 很難發(fā)現ECM中的膠原纖維，這表明PLGA已經滲入ECM內部，并在孔隙內表面形成膜狀結構，由此推測，NGF明膠微球和賴氨酸也被 PLGA包封起來從而形成一種有效的NGF、賴氨酸緩釋體系。斷面 (圖2B) 中可以觀察到直徑為8 μm左右的圓球狀顆粒，這是完整的NGF明膠微球。還可以觀察到直徑為0.5 μm左右的粉末狀顆粒，它們可能是明膠微球在支架加工成型過程中崩解所造成的。這些粉末可能是 NGF、明膠、賴氨酸的混合物。不過，仍有理由相信，它們也被 PLGA在表面進行了輕度的覆蓋。它們的存在可能會導致支架在降解的早期對NGF暴釋。在支架的斷面 (圖2B) 中體現出了眾多遠大于10 μm的孔隙，這為雪旺氏細胞及軸突的侵入提供了足夠的內部空間。

2.3 力學性質

材料的力學性質也是神經支架的重要性質之一。在移植過程中需要耐受手術操作而保持形態(tài)，在移植后也需要耐受肌肉收縮等原因所導致的拉伸和擠壓。豬皮來源的ECM主要由于膠原纖維構成，具有很好的機械強度。PLGA具有較好的剛性。在ECM和PLGA所組成的復合材料中，韌性主要由膠原所決定，硬度由PLGA決定。二者的含量以及混合的均勻程度都會導致復合材料力學性質的變化。本神經支架的斷裂強度為8.308 MPa，斷裂伸長率為38.98%，彈性模量為97.27 MPa. 這說明其強度高，具有一定的彈性，硬度適中。

圖1 新鮮豬皮與豬皮來源的ECM的內部形態(tài)Fig. 1 Morphology of fresh pigskin and acellular pigskin. (A) Fresh pigskin (HE staining). (B) ECM (HE staining). (C) Fresh pigskin (SEM). (D) ECM (SEM).

圖2 神經支架的形態(tài)Fig. 2 Structure of the scaffold (SEM). (A) Surface. (B) Cross section.

2.4 降解性質

在PBS中降解4周后發(fā)現，神經支架的最大吸水率為126%，最大失重率為43.3%，而對照組豬皮來源的ECM的最大吸水率為300%，最大失重率為9.9% (圖3)。支架中的PLGA逐步降解，在第4周時幾乎僅剩下ECM的成分 (圖4)。這表明此時的支架應該已經不具備對 NGF和賴氨酸的持續(xù)釋放功能，如果希望要延長這樣的過程，則在支架的制備中需要增加PLGA的含量。在8周的考察期中 (圖5)，降解液中的pH體現出了一個逐步緩慢降低的趨勢，相對于對照組 (PLGA) 而言，支架組的pH 降低的趨勢較為平緩。這表明賴氨酸在支架中的添加能中和PLGA降解過程中所釋放的弱酸性物質，以穩(wěn)定環(huán)境pH。賴氨酸的釋放應該在4周左右結束 (圖4D)，但是，在4~8周的降解過程中 (圖5)，支架組降解液的pH仍略高于對照組 (PLGA)，這或許是豬皮來源ECM的降解性質所決定的。

2.5 支架對NGF的緩釋性質

支架對NGF的緩釋曲線 (圖6) 顯示，在第1天屬于NGF的暴釋期，累積釋放量占整個考察期 (30 d) 累積釋放率 (38%) 的40%左右。在開始1周的累積釋放量占考察期 (30 d) 累積釋放率 (38%) 的60%左右。

2.6 雪旺氏細胞在神經支架上的粘附與增殖

將支架與雪旺氏細胞共培養(yǎng)7 d，以單獨培養(yǎng)的雪旺氏細胞作為對照 (Control)，同時在另一實驗組中一次性添加NGF。結果 (圖7) 顯示，在各組中雪旺氏細胞的增殖趨勢相同，但是仍體現出細胞數量的不同。細胞增殖速度由低到高的排列順序依次為：對照組、支架組、單獨添加NGF組。這一結果表明支架中NGF保持了生物活性。將支架與雪旺氏細胞通過15 d的共培養(yǎng)，能夠觀察到雪旺氏細胞在支架表面的粘附 (圖8)。

圖3 神經支架質量的殘留率 (失重率)Fig. 3 Weight remaining of the scaffolds and PLGA.

圖4 支架在降解過程中的形態(tài)變化Fig. 4 Changes of the scaffold surface during degradation in PBS solution. (A) 1 week. (B) 2 weeks. (C) 3 weeks. (D) 4 weeks.

圖5 支架在水中降解的過程中環(huán)境pH的變化Fig. 5 Changes of pH value in degradation solution.

圖6 支架對NGF的緩釋作用Fig. 6 NGF release ratio of the scaffold.

圖7 雪旺氏細胞的MTT試驗Fig. 7 MTT assay of schwan cells.

圖8 雪旺氏細胞在支架表面的粘附Fig. 8 Schwann cell adhering to the scaffold.

3 結論

研究結果表明，本研究所制備的復合材料具有如下性質：適宜的強度、彈性和硬度；內部蜂窩狀結構；易降解；對NGF的緩釋功能；保持了NGF的生物活性；對PLGA降解過程中所產生的酸性物質具有一定的中和作用；對雪旺氏細胞有較好的親和性。這些性質都是神經支架所需要滿足的條件，因此有望成為一種新型的促周圍神經損傷修復支架。

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