焦志華徐娥陸平李衛(wèi)芬

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058；2.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025)

木聚糖酶在飼料、造紙、食品、能源工業(yè)和環(huán)境科學(xué)上都有著十分廣闊的用途,在飼料中添加木聚糖酶可以降解植物細(xì)胞壁,有利于動(dòng)物的消化和吸收,提高飼料的利用率；木聚糖酶還可以降解可溶性多糖,降低其黏稠性，減少畜禽的腸道疾病,提高畜禽的成活率,同時(shí)還能減少環(huán)境污染。郝瑞英等[1]研究表明，斷奶仔豬低磷飼糧中添加木聚糖酶能增加鈣、磷的利用率,促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)。俞沛初等[2]研究表明,添加木聚糖酶可顯著提高仔豬對(duì)能量、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維等的表觀消化率,同時(shí)結(jié)果還表明,添加外源酶可使仔豬腸道某些內(nèi)源性消化酶的分泌量增加。徐駿等[3]研究表明,添加0.05%木聚糖酶能提高試驗(yàn)組仔雞增重,降低料重比。

木聚糖酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中,不同來(lái)源的木聚糖酶在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上有很大的差別。微生物是木聚糖酶的重要來(lái)源,它產(chǎn)生的木聚糖酶具有活力高、成本低、來(lái)源穩(wěn)定、提取方便等明顯優(yōu)點(diǎn),但是天然菌株產(chǎn)生木聚糖酶的量較低,限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。當(dāng)前研究的熱點(diǎn)是通過(guò)基因工程將木聚糖酶基因進(jìn)行外源表達(dá),以提高木聚糖酶的產(chǎn)量,解決其在應(yīng)用中的瓶頸問(wèn)題。目前已有很多微生物的木聚糖酶基因被克隆測(cè)序并進(jìn)行了異源表達(dá)[4-5],其中細(xì)菌木聚糖酶主要來(lái)自于芽孢桿菌屬,如環(huán)狀芽孢桿菌(B.cirxulans WL-12)[6]、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[7]、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermopHilus T-6)[8]等,但是由于表達(dá)系統(tǒng)的差異,無(wú)法進(jìn)行表達(dá)量和木聚糖酶性質(zhì)的綜合比較。因此,有必要對(duì)不同來(lái)源的芽孢桿菌木聚糖酶基因在同一表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá),然后對(duì)各表達(dá)產(chǎn)物的酶活、最適反應(yīng)溫度及耐熱性進(jìn)行分析比較,以期尋找能在大腸桿菌中穩(wěn)定表達(dá)，并能產(chǎn)生高活性、耐高溫的木聚糖酶的基因,為工業(yè)上大量生產(chǎn)木聚糖酶提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體與主要試劑

浸麻芽孢桿菌（B.macerans）B3株、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)B6株、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)B10株和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)B12株、克隆宿主菌E.coli TOP10和表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)載體pET-30a(+)購(gòu)自Invitrogen公司；pUCm-T vector購(gòu)自Promega公司；木聚糖購(gòu)自Sigma公司；X-Gal、IPTG、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶和各種限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司(大連)；DNA Marker購(gòu)自MBI公司(Maryland)；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR清洗試劑盒、割膠回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程公司。

1.2 木聚糖酶基因的PCR擴(kuò)增

參照GenBank上B.subtilis和B.cirsulans木聚糖酶基因的序列，用軟件Primer5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，序列為：

上游引物(5PX)：5'-AGGGGATCCATGTTTAAGTT TAAAAAGAAT-3'；

下游引物(3PX)：5'-GATCTCGAGTTACCACACTGTTACGTTA-3'，分別加入BamHⅠ和XhoⅠ，由上海生物工程公司合成。

分別以B.macerans B3株、B.licheniformis B6株、B.cereus B10株和B.subtilis B12株為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液(含Mg2+)5.0 μl；dNTP(10 mM)1.0 μl；引物各1.0 μl；模板DNA 1.0 μl；Ex Taq 0.5 μl，加水至50 μl。PCR反應(yīng)條件為：首先94℃預(yù)變性5 min；然后94℃變性40 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，反應(yīng)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定。

1.3 4種木聚糖酶基因的克隆及測(cè)序

分別割膠回收4個(gè)目的基因片段，并與pUCm-T vector連接,陽(yáng)性克隆送往上海博亞生物公司進(jìn)行測(cè)序,用DNA tool 5.0軟件進(jìn)行分析,并在網(wǎng)上進(jìn)行同源分析,通過(guò)scanprosite服務(wù)器分析酶家族。陽(yáng)性克隆子命名為pUCm-T-xyl-BX,其中X區(qū)分4種木聚糖酶基因。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒及基因工程菌的構(gòu)建

將提取的質(zhì)粒pUCm-T-xyl-BX與載體pET-30a(+)分別用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，xylBX片段插入到pET-30a(+)的相應(yīng)位點(diǎn)，分別得到重組質(zhì)粒pET-30-xyl-BX。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到相應(yīng)的工程菌BL21-xyl-BX。

1.5 目的蛋白表達(dá)

挑取單菌落接種于2.0 ml含100 μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃150 r/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜，取1 ml菌液轉(zhuǎn)接于50 ml含卡那霉素的LB中，150 r/min振搖培養(yǎng)至OD600到0.6左右，加入IPTG至終濃度為1 mmol/l，誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。

1.6 目的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE鑒定

取1.0 ml菌液4℃離心菌液收集菌體,用80.0 μl磷酸鹽緩沖液懸浮，加入20.0 ml 5×SDS-PAGE上樣緩沖液裂解,沸水浴變性處理10 min,4℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液10 μl進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.7 木聚糖酶學(xué)特性

誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體并超聲破碎，破碎液4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液為粗酶液，用于酶活力測(cè)定和酶學(xué)特性分析。參照Miller等[9]文獻(xiàn)，采用DNS法測(cè)定木聚糖酶活。

在試管中加入1 000 μl濃度為0.5%的木聚糖底物，預(yù)熱5 min，然后加入粗酶液100 μl，55℃準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，加入500 μl DNS溶液終止反應(yīng)，沸水浴5 min，冷卻后于540 nm處比色，測(cè)定OD值。根據(jù)木聚糖酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算4種木聚糖酶的酶活。

水波相送，古道相迎，粉墻靜立，青磚不語(yǔ)，關(guān)于這座古鎮(zhèn)的印象，尚等細(xì)讀拾取。春江水暖、雁字回時(shí)再重游，好好感受古鎮(zhèn)清晨的寂靜，午后黃昏的紛華，藍(lán)天碧水的映襯，霓虹燈影的點(diǎn)綴……其實(shí)已沉醉在千年古鎮(zhèn)的槳聲燈影里。

酶活力單位(U)定義：每秒鐘水解木聚糖底物產(chǎn)生1 μmol木糖的酶量為1個(gè)木聚糖酶活力單位。

木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性的測(cè)定方法參照Luo等[10]文獻(xiàn)，在40～90℃范圍內(nèi)，每隔10℃設(shè)定1個(gè)反應(yīng)溫度，調(diào)節(jié)pH值7.0，反應(yīng)10 min后，分別測(cè)定4種重組木聚糖酶在各溫度下的酶活。不同木聚糖酶分別以各自在不同溫度下的最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活，由此確定4種不同木聚糖酶的最適溫度。

酶熱穩(wěn)定性測(cè)定：4種不同酶液分別在40、50、60、70、80℃處理20 min，立即冰浴，然后測(cè)定殘余酶活性，以未處理酶樣活性為100%。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆和序列分析

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，4個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在650 bp左右均有一條特異條帶，與預(yù)期大小一致。

測(cè)序結(jié)果表明，4個(gè)木聚糖酶基因大小均為642 bp。經(jīng)BLAST相似性分析后，結(jié)果顯示，浸麻芽孢桿菌B3株的木聚糖酶基因、地衣芽孢桿菌B6株的木聚糖酶基因和蠟樣芽孢桿菌B10株的木聚糖酶基因與已登錄的枯草芽孢桿菌木聚糖酶基因（登錄號(hào)為U51675、X59058和AF490979）序列相似性都在90%以上?？莶菅挎邨U菌B12與已登錄的枯草芽孢桿菌木聚糖酶基因（登錄號(hào)為Z99114、AF02786和M36648）序列完全一樣。其中除枯草芽孢桿菌B12木聚糖酶基因外，其他3個(gè)木聚糖酶基因均首次報(bào)道。

通過(guò)網(wǎng)上Clustal W軟件對(duì)4種木聚糖酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，這4個(gè)基因序列相互間的同源性在92%～98%間，其中，浸麻芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌木聚糖酶基因的同源性最低，為92%。同樣，對(duì)4種芽孢桿菌木聚糖酶基因的推譯氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些氨基酸序列的同源性都在95%以上，其中浸麻芽孢桿菌和枯草桿菌及蠟樣芽孢桿菌之間的同源性最低，為95%（如圖2）。

Scanprosite分析各木聚糖酶基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)4種酶均屬于糖苷鍵水解酶11家族，都具有特征活性位點(diǎn)序列PLIEYYVVDSW(103～113)，蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌木聚糖酶還具有該家族的另一個(gè)特征序列MATEGYQSSGSS(197～208)。

2.2 木聚糖酶SDS-PAGE分析（見(jiàn)圖3）

2.3 重組木聚糖酶的性質(zhì)

2.3.1 重組木聚糖酶的酶活

4種重組酶工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后在55℃條件下測(cè)得的木聚糖酶活力差異較大，其中枯草芽孢桿菌木聚糖酶活力最高，達(dá)到98.98 U/ml，其它依次為：浸麻芽孢桿菌為36.16 U/ml，蠟樣芽孢桿菌為7.22 U/ml，地衣芽孢桿菌為3.85 U/ml。

地衣芽孢桿菌和短芽孢桿菌木聚糖酶氨基酸序列同源性為100%，而短芽孢桿菌木聚糖酶的酶活力為地衣芽孢桿菌木聚糖酶的6.8倍，分析原因，兩者基因序列的同源性為98%，其中地衣芽孢桿菌木聚糖酶基因中有較多相對(duì)于表達(dá)宿主而言的稀有密碼子，如編碼木聚糖酶的第92位氨基酸殘基Gly的密碼子在地衣芽孢桿菌和短芽孢桿菌中分別為GGA和GGG，其中前者為稀有密碼子。

2.3.2 重組木聚糖酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性（見(jiàn)圖4～圖5）

由圖4可知，4種重組酶的最適反應(yīng)溫度均在50～60℃之間，當(dāng)反應(yīng)溫度低于50℃時(shí)，4種酶相對(duì)酶活力均較穩(wěn)定；當(dāng)反應(yīng)溫度高于60℃，4種酶相對(duì)酶活力均迅速下降，但枯草芽孢桿菌木聚糖酶的相對(duì)酶活力始終高于其它3種酶，在70℃時(shí)，枯草芽孢桿菌木聚糖酶相對(duì)酶活力為73.6%，而浸麻芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌木聚糖酶的相對(duì)酶活力分別為35.2%、50%和33.3%。

由圖5可知,除蠟樣芽孢桿菌木聚糖酶外,其它3種木聚糖酶的相對(duì)耐熱溫度均為50℃。蠟樣芽孢桿菌木聚糖酶經(jīng)50℃處理20 min完全失活,其它3種木聚糖酶中枯草芽孢桿菌木聚糖酶殘余相對(duì)酶活力最高,為85%,浸麻芽孢桿菌木聚糖酶殘余相對(duì)酶活為65%,地衣芽孢桿菌木聚糖酶殘余相對(duì)酶活最低,為56.6%。當(dāng)溫度高于60℃時(shí),其他3種酶的相對(duì)酶活力均迅速下降,其中枯草芽孢桿菌木聚糖酶相對(duì)來(lái)說(shuō)最為耐熱。

3 討論

木聚糖酶具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，在飼料、食品、釀酒、醫(yī)學(xué)、紡織、造紙、環(huán)境和能源等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。特別是在飼料工業(yè)中，木聚糖酶能有效地提高飼料利用率。自然界中分離出的能夠產(chǎn)木聚糖酶的微生物大多存在著復(fù)雜的酶系，使得木聚糖酶的分離純化比較困難。目前應(yīng)用較多的是通過(guò)基因工程將木聚糖酶基因連接到合適的載體上并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌中，這樣可以簡(jiǎn)化木聚糖酶純化過(guò)程[11]。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)由于具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、操作工藝成熟、培養(yǎng)周期短、蛋白表達(dá)量大等優(yōu)點(diǎn)[12]，仍是目前應(yīng)用最普遍的一種表達(dá)系統(tǒng)。但是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的外源蛋白通常以包涵體的形式存在。研究認(rèn)為，包涵體形成可能是木聚糖酶自身氨基酸序列的緣故，折疊時(shí)不能迅速被大腸桿菌識(shí)別,導(dǎo)致翻譯后的多肽鏈聚集成包涵體[13]。目前,已有多種方法用來(lái)解決蛋白過(guò)量表達(dá)時(shí)出現(xiàn)的包涵體的問(wèn)題,如共表達(dá)分子伴侶、降低表達(dá)溫度、分泌到胞外培養(yǎng)基或周質(zhì)空間等[14]。有研究報(bào)道,氨基酸突變能增加重組蛋白的可溶性[15],本實(shí)驗(yàn)室的后續(xù)研究會(huì)在這方面進(jìn)行嘗試。

不同來(lái)源的木聚糖酶主鏈聚合度不同，支鏈殘基的種類(lèi)、數(shù)量、長(zhǎng)度以及在主鏈上的結(jié)合位點(diǎn)不同，所以有不同類(lèi)型的木聚糖酶。從分子角度來(lái)講，這通常是由多個(gè)基因表達(dá)為幾種同工酶的形式，也可能是由單個(gè)基因通過(guò)表達(dá)后修飾產(chǎn)生多個(gè)不同產(chǎn)物所致。這些表達(dá)后修飾包括mRNA的剪切，翻譯后蛋白的糖基化、?；揎椧约皝喕木酆系取Ｄ壳?，許多生產(chǎn)中都離不開(kāi)嗜極性木聚糖酶(包括嗜熱、嗜堿和嗜酸等)，如在食品工業(yè)中，很多加工都需要熱處理，這就要求木聚糖酶在較高的溫度下仍有較高的酶活；在造紙工業(yè)中，紙漿漂白環(huán)境為堿性，木聚糖酶需要在高pH值的環(huán)境下依然能保持較高的活性[16]。為使木聚糖酶更加高效地應(yīng)用于生產(chǎn)中，一方面可以從一些耐極性細(xì)菌中篩選木聚糖酶基因進(jìn)行外源表達(dá)；另一方面可以通過(guò)基因工程手段進(jìn)行修飾，使得表達(dá)后的木聚糖酶具有耐熱、耐酸堿等性質(zhì)。許多真菌產(chǎn)酸性木聚糖酶普遍存在糖基化現(xiàn)象，如Talaramyces byssochiamydoides YH-50等，通常認(rèn)為，糖基化與酶抵御極端環(huán)境、維持其穩(wěn)定性有關(guān)[17]。另外，可以通過(guò)在蛋白質(zhì)的N末端附近一個(gè)殘基的置換和嵌合改變，引入二硫橋，使木聚糖酶的穩(wěn)定性得到很大的提高，同時(shí)使在堿性條件下作用的pH值范圍也得到了擴(kuò)展[17]。

4 結(jié)論

本研究對(duì)4種不同木聚糖酶基因在同一宿主菌中進(jìn)行外源表達(dá)，并測(cè)定比較了表達(dá)產(chǎn)物的酶活、最適反應(yīng)溫度及耐熱性等。試驗(yàn)結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌木聚糖酶在大腸桿菌中表達(dá)后的酶活、最適溫度、耐熱性相對(duì)較好。后續(xù)試驗(yàn)可以通過(guò)上述其他手段提高木聚糖酶的表達(dá)量、酶活及耐極性等。

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