戴 欣 ，楊 航 ，石 巖 ，魯 雪 ，王玲靜 ，李 聰

（1.松遼流域水資源保護(hù)局松遼流域水環(huán)境監(jiān)測中心，吉林 長春 130021；2.河海大學(xué)，江蘇 南京 210098）

分光光度法測定水體中葉綠素a含量的改進(jìn)

戴 欣1，楊 航1，石 巖1，魯 雪1，王玲靜2，李 聰1

（1.松遼流域水資源保護(hù)局松遼流域水環(huán)境監(jiān)測中心，吉林 長春 130021；2.河海大學(xué)，江蘇 南京 210098）

本文在大量實驗基礎(chǔ)上對分光光度法測定水體中葉綠素a方法進(jìn)行了改進(jìn)研究。實驗結(jié)果表明：過濾藻類使用玻璃纖維濾膜結(jié)果要優(yōu)于普通微孔濾膜;提取過程中用反復(fù)凍融法結(jié)果優(yōu)于研缽研磨法。

分光光度法；葉綠素a；改進(jìn)措施

0 引言

葉綠素a是浮游性藻類植物體內(nèi)重要化學(xué)成分，通過測定水體中藻類體內(nèi)葉綠素的含量可以推斷出水體中浮游植物的數(shù)量，進(jìn)而表征水體富營養(yǎng)化的程度。

目前國內(nèi)測定葉綠素a的方法主要是使用分光光度法和熒光法，其中分光光度法較為常用。方法上主要采用SL88-1994[1]標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法，但該標(biāo)準(zhǔn)方法在實踐工作中還存在著實驗結(jié)果平行性不好、葉綠素a提取效率不高等問題，因此，為了使測定葉綠素的標(biāo)準(zhǔn)方法更加完善，有必要對方法進(jìn)行改進(jìn)。

以下針對原方法中樣品保存、水樣處理等環(huán)節(jié)存在的問題進(jìn)行了一系列實驗，提出了有效的改進(jìn)措施。

1 實驗部分

1）試劑。碳酸鎂懸濁液，ω（MgCO3）=1%；丙酮溶液，ρ（C3H6O）=90%(V/V)；鹽酸溶液，C(HCl)=0.1 mol/L。

2）儀器和設(shè)備?？梢姺止夤舛扔?；抽濾器；微孔濾膜，直徑為47 mm、孔徑為0.7 μm的玻璃纖維濾膜；真空泵；低溫冰箱，能控制在-40℃±1℃；離心機(jī)，轉(zhuǎn)速能達(dá)到3 000～4 000 r/min，宜使用帶控溫裝置的離心機(jī)。

3）水樣采集。根據(jù)不同的水體，采集500～1 000 ml水樣于棕色玻璃瓶或深色塑料瓶中，每升水樣加入1%的碳酸鎂懸濁液1 ml，以防止酸化引起的色素溶解。

4）樣品富集。將微孔濾膜放置在連接有真空泵的抽濾器上，根據(jù)水樣的富營養(yǎng)化程度準(zhǔn)確量取定量體積的混勻水樣進(jìn)行抽濾，抽濾時負(fù)壓不應(yīng)超過20 kPa，逐漸減壓，在水樣剛剛完全通過濾膜時結(jié)束抽濾。用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品的一面對折，用濾紙吸干剩余水分。如樣品不能及時提取，應(yīng)將吸干水分的濾膜放入培養(yǎng)皿中，外面包裹一層鋁箔，放入-20℃以下的冰箱中保存。

5）提取。將過濾后的濾膜放入帶有螺帽的離心管中，旋緊螺帽，放入-40℃低溫冰箱中冷凍20 min，取出放置于室溫下5 min，此過程反復(fù)3次。向離心管中加入90%丙酮溶液10 ml，蓋緊旋帽劇烈搖振片刻，放置于4℃冰箱中避光浸泡4～12 h備用。

6）離心。將離心管放入離心機(jī)中，以3 500 r/min的速度離心15 min。

7）測定和計算。將離心后的上清液倒入1 cm比色皿中，以 90%丙酮溶液做參比，分別在 750，664，647，630 nm波長處測定吸光度值。帶入到計算公式中計算結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 過濾藻類的濾膜對測定結(jié)果的影響

SL88-1994標(biāo)準(zhǔn)方法使用的是一般微孔濾膜，多為醋酸纖維材質(zhì)。葉綠素a測定時要求750 nm處吸光度值低于0.005，因醋酸纖維濾膜在丙酮溶液中溶解，用一次離心方法有時很難達(dá)到分析要求。在實際測試中，使用醋酸纖維濾膜，樣品在750 nm處的吸光度為0.008～0.019，平均0.012。該方法參考美國EPA標(biāo)準(zhǔn)[2]使用玻璃纖維濾膜，雖然價格稍高，但可以有效地避免濾膜的溶解對測定結(jié)果的影響。在實際測試中，樣品750 nm處的吸光度值為0～0.005，平均為0.002，可以滿足750 nm處吸光度值低于0.005的要求。實驗結(jié)果見表1。

2.2 不同提取方法對測定結(jié)果的影響

SL88-1994標(biāo)準(zhǔn)中使用研缽研磨濾膜。研缽是開放式的器皿，完全由實驗人員手工操作，實驗中使用的溶劑丙酮易揮發(fā)，對人體產(chǎn)生危害；另外研缽內(nèi)壁不平整，極易粘附濾膜殘渣，不易洗脫，易造成樣品損失；由于實驗人員的差異，對研磨的操作不盡相同，容易引起實驗結(jié)果重現(xiàn)性差。

本方法中使用的反復(fù)凍融法[3]，即使用超低溫冰箱對濾膜上的藻類進(jìn)行反復(fù)冰凍-融化操作，使藻類細(xì)胞壁破裂，再使用丙酮進(jìn)行提取。反復(fù)凍融法不但具有易操作、葉綠素?fù)p耗少、溶劑揮發(fā)較少、操作平行性好、一次可處理大批樣品、勞動強(qiáng)度少等優(yōu)點，還可以有效提高實驗結(jié)果的重現(xiàn)性。

表1 使用不同材質(zhì)的微孔濾膜在750 nm處吸光度值對比

課題組在其他測定條件不變的情況下，分別使用研缽研磨和反復(fù)凍融法對兩組水樣中葉綠素a進(jìn)行了測定，可以看出，使用反復(fù)凍融法提取葉綠素a結(jié)果明顯優(yōu)于研缽的結(jié)果，實驗結(jié)果列于表2及圖1、圖2。

表2 使用不同提取方法提取葉綠素的檢測結(jié)果 μg/L

3 結(jié)語

實驗結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法使用玻璃纖維濾膜能有效地減少濾膜溶解對樣品提取液的干擾，提高了測定的準(zhǔn)確度水平；使用反復(fù)凍融法效地減少了操作步驟、保護(hù)了操作人員健康、同時可以處理大批樣品，同時還有效地提高了實驗結(jié)果的重現(xiàn)性。

［1］ SL88-1994，葉綠素的測定（分光光度法）［S］.

［2］EPA446.0,In Vitro Determination of Chlorophylls a,b,c1+c2 and Pheopigments in Marine And Freshwater Algae by Visible Spectrophotometry.

［3］張潔梅,張哲海.應(yīng)用凍融法測定湖泊水中葉綠素a含量［J］.云南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，31(S2)：497—498.

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