劉婷婷， 殷幼平， 林亞玉， 賢家旭， 陳世偉， 王中康＊

（1．重慶大學(xué)生物工程學(xué)院基因研究中心，重慶 400030；2．廣西利添生物科技發(fā)展 （合浦）有限公司，北海 536128）

柑橘黃龍病 （Citrus Huanglongbing，HLB）是影響世界柑橘產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性病害［1］。該病害至今未能得到穩(wěn)定的純培養(yǎng)，妨礙了病害侵染機(jī)理的深入研 究［2］。Jeong－Soon Ki m［3］、Ute Albrecht［4］用生物芯片技術(shù)對柑橘染病后體內(nèi)的基因表達(dá)進(jìn)行了研究，從分子角度對柑橘被黃龍病菌侵染后的反應(yīng)進(jìn)行了分析。利用寄主抗病性是防治病害的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，國際對于柑橘的分子抗性育種也正在研究中［5］，但尚未有商用的抗性品種問世。依據(jù)現(xiàn)有的研究報道及田間觀察，發(fā)現(xiàn)長期生長在柑橘黃龍病病區(qū)的多年生柚樹（10～30年）病害癥狀不明顯，對黃龍病呈現(xiàn)一定程度的耐病性，是抗黃龍病育種的潛在的基因資源，因此可以由此入手分析其抗病相關(guān)基因的特性。迄今為止，已經(jīng)分離鑒定出約50余種抗病基因［6］，通過對這些基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)產(chǎn)物具有特定的保守結(jié)構(gòu)域，如核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（nucleotide binding site，NBS）、亮氨酸重復(fù)序列（leucine－rich repeat，LRR）、絲氨酸／蘇氨酸蛋 白 激酶（serine－threonine kinase，STK）等［7－8］。根據(jù)已知抗病基因表達(dá)產(chǎn)物的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物PCR擴(kuò)增得到的序列稱為抗病基因同源序列（resistance gene analogs，RGAs），目前通過該方法已經(jīng)從甘蔗［9］、姜［10］、杏［11］、大豆［12］、小麥［13］等植物中擴(kuò)增得到了大量RGAs。但是從基因組中得到的RGA可能有不表達(dá)的假基因，而從c DNA中分離的RGA則一般都是表達(dá)序列［14］，通過對已克隆RGA的分析，并不是所有的RGA都與抗病基因相關(guān)，因此需要對得到的RGA進(jìn)行抗病相關(guān)性的分析和鑒別以確定抗病相關(guān)基因?；虻墓δ芸梢酝ㄟ^基因的表達(dá)特征反映出來，定量PCR是研究基因表達(dá)較為靈敏、快速、簡單的方法，目前已經(jīng)在各個研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［15］。利用定量PCR技術(shù)，蔡高磊等［16］研究了小麥Ta OZR基因的表達(dá)情況，張薇等［17］對煙草激活蛋白Pea T1的誘導(dǎo)抗性作用進(jìn)行了研究，楊立桃等［18］對轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行了分析。本研究利用較耐病的柑橘屬柚c DNA為模板，根據(jù)植物抗病基因表達(dá)產(chǎn)物的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物擴(kuò)增抗病基因相似序列，然后設(shè)計特異性引物，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，驗(yàn)證抗性基因相似序列與黃龍病菌侵染的相關(guān)性，期望獲得具有抗病基因保守區(qū)域的黃龍病抗性候選基因，為黃龍病抗性基因的克隆及抗病基因作用機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料處理及RNA提取

供試植物為10年生琯溪蜜柚葉片（福建長泰）與奧林達(dá)夏橙（由廣西合浦烏家柑橘種植場提供）。甜橙采取兩組處理方式，一組嫁接黃龍病病芽（T），一組不嫁接作為空白對照（C），每組8棵植株。處理后的兩組植物分別放于溫室內(nèi)培養(yǎng)，保持持續(xù)的自然光照射，溫度為17～25℃。嫁接1個月后開始取樣，每株取3片葉片，以后每個月取1次連續(xù)取8個月。每次取的樣品洗凈后液氮速凍后于－80℃冰箱保存。提取DNA，選取定量PCR檢測為陽性的3株樣品用于進(jìn)一步試驗(yàn)。用Trizol法提取植物的總RNA，每組樣品3個生物重復(fù)，RNase－free DNase I處理樣品以排除DNA的污染，分光光度計檢測樣品，并于1．0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測RNA的完整性，A260nm／A280nm的比值在1．8～2．0之間的樣品利用隨機(jī)引物和M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成c DNA第1鏈。

1．2 RGA的擴(kuò)增及序列分析

根據(jù)抗性基因保守區(qū)利用Pri mer5．0設(shè)計簡并引物（表1），以琯溪蜜柚c DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物于1．5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，回收、連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆酶切，篩選部分差異陽性克隆測序。序列輸入Gen Bank進(jìn)行Blast比對，ORF Finder用于尋找RGA的開放閱讀框。推導(dǎo)的氨基酸序列與已克隆的NBS類抗性基因利用DNA MAN軟件進(jìn)行序列比對，尋找其保守區(qū)域，并利用Cl ustal x及MEGA4進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

表1 PCR擴(kuò)增所需引物1）

1．3 定量PCR表達(dá)分析

根據(jù)測序結(jié)果利用beacon designer 7．0設(shè)計特異性定量引物（表2），對甜橙c DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)驗(yàn)證后的特異性引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系為25μL，其中包括 SYBGREEN Mix 12．5μL，10μmol／L引物各1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μL作為模板，每個樣品3個技術(shù)重復(fù)，空白處理水為模板以排除污染。最后通過IQ5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表2 用于實(shí)時熒光定量PCR的引物

2 結(jié)果與分析

2．1 柚子c DNA RGA的克隆與序列分析

利用引物對柚c DNA進(jìn)行擴(kuò)增，將目的條帶進(jìn)行回收和克隆，通過RFLP篩選差異陽性克隆，共選取6個送去測序，分別命名為GJ10、GJ17、GJ20、GJ28、GJ31、GJ35，通過DNA MAN軟件將序列與煙草N、亞麻L6、擬南芥RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等基因進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)除GJ17以外，其余5個序列與選取的R基因具有一致的NBS保守區(qū)（P－loop、kinase－2、GLPL 等）（圖1），上傳到 Gen Bank中，登錄號為H M777043～HM777047。同時，序列分析顯示其在氨基酸水平上的相似性為分別為32．52%、19．71%、28．41%、39．23%、42．86%。通過Clustalx，MEGA等軟件進(jìn)行進(jìn)一步的系統(tǒng)分析，構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2），如圖所示5個RGAs與擬南芥RPS2、RPS5形成一個分支，擬南芥RPM1、RPP8和土豆I2C屬于一個分支簇，亞麻L6和煙草N 屬于一個分支簇。

2．2 定量PCR的表達(dá)分析

為確定得到的RGAs是否受黃龍病誘導(dǎo)而表達(dá)變化，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)分析其表達(dá)。根據(jù)得到的RGAs設(shè)計的特異性引物以甜橙c DNA為模板均能夠得到擴(kuò)增曲線，經(jīng)克隆測序驗(yàn)證屬于甜橙序列，因此可利用定量PCR方法研究黃龍病侵染過程中5個RGAs的表達(dá)情況。同時，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室石小剛博士的研究結(jié)果，GAPDH和NADH是分析柑橘黃龍病侵染過程中基因表達(dá)最合適的內(nèi)參基因［19］。結(jié)果（圖3）顯示在嫁接病芽后8個月的連續(xù)采樣中5個RGAs的表達(dá)受到不同程度的調(diào)控，GJ20和GJ31在試驗(yàn)組第2次采樣中表達(dá)量大幅上升，而在嫁接病原前后的其余月份中表達(dá)相對比較穩(wěn)定；GJ28在試驗(yàn)組第4次采樣時表達(dá)上調(diào)，其余幾個月表達(dá)趨于穩(wěn)定；GJ35在嫁接病原后總體表達(dá)較對照組大幅度下調(diào)；GJ10在嫁接病原后3個月時表達(dá)下降，其余月份與對照組幾乎達(dá)到平衡。

圖1 克隆得到的5個RGAs推導(dǎo)的氨基酸序列與7個已知抗病基因NBS保守結(jié)構(gòu)域的比對

圖2 5個序列推導(dǎo)的氨基酸與已知物種抗病基因蛋白產(chǎn)物的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

由于黃龍病寄主植物通常樹體大，生長周期長，很難通過傳統(tǒng)方法克隆抗性基因，RGAs的分離鑒定及表達(dá)分析可以為抗性基因的克隆提供一定的線索，但是利用基因組DNA為模板擴(kuò)增得到的RGA或許包含內(nèi)含子，而從c DNA中得到的序列則是無終止子的編碼序列。迄今為止，從柚c DNA中分離鑒定RGA僅見1篇報道［20］，他們以柚花柱c DNA為模板擴(kuò)增得到了10個序列，但并未對其進(jìn)行表達(dá)特性的研究分析。本試驗(yàn)從柚c DNA中成功獲得5個RGAs，所得到的5個RGAs與7個已知的植物抗性基因的NBS保守區(qū)域具有高度相似性。然而，核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）僅僅是植物抗性基因的一個保守區(qū)域，它不僅在抗性基因中存在，在ATP和GTP結(jié)合蛋白中也存在［21］。除了核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS），柚NBS－LRR類抗性基因還應(yīng)具有其他的重要 結(jié) 構(gòu)，例 如 TOLL、TIR（Interluken－1－receptor）或LRR（Leucine－rich repeats），因此所得到的5個RGAs只能作為抗性候選基因。

圖3 接種黃龍病后5個RGAs的相對表達(dá)分析

為證實(shí)本研究得到的抗病同源基因是否為抗黃龍病相關(guān)基因，采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)來觀察其在黃龍病病原侵染過程中的表達(dá)是否發(fā)生變化，如果能被誘導(dǎo)進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，則可能是抗病候選特異基因，參與病原侵染過程。由于柚感染黃龍病后相關(guān)癥狀表現(xiàn)并不十分明顯，尤其是多年生的大樹，甚至并不能被病原所感染。本試驗(yàn)嫁接柚多次未能得到感染株，遂利用得到全部感染病程的奧林達(dá)夏橙作為定量PCR的材料，因此試驗(yàn)結(jié)果或許會有些許差異。本試驗(yàn)中的5個RGAs經(jīng)實(shí)時熒光定量PCR后，其表達(dá)量均有所變化，可以初步確定為抗病相關(guān)基因，但是其表達(dá)只是在特定時期發(fā)生微量變化，推測除了病原其表達(dá)可能同時也受其他因素的影響。其中GJ20和GJ31在接種后第2月表達(dá)量大幅度上升，其余月份表達(dá)穩(wěn)定，根據(jù)黃龍病的生長情況推測其可能是因?yàn)樵谇秩境跗诓【鷶?shù)量相對較少，對基因表達(dá)的誘導(dǎo)不強(qiáng)；而后病菌增殖，致使相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)，又反過來抑制了病菌繁殖，使得基因表達(dá)下降并最終趨于穩(wěn)定。GJ10、GJ28和GJ35的表達(dá)相對來說無明顯的規(guī)律。根據(jù)表達(dá)情況，推測GJ20和GJ31較有可能與HLB菌的相關(guān)抗性基因相關(guān)，進(jìn)一步的試驗(yàn)主要是通過獲得其全長序列，構(gòu)建表達(dá)載體，通過RNAi技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證，以確定其功能。

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