于志輝 宿婷婷 任翠華 李 釩 夏定國(guó)程水源

(1北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院,北京100124;2北京大學(xué)工學(xué)院,北京100871)

1 引言

酶是一種具有生物活性的蛋白質(zhì),酶的氧化還原活性中心與載體之間的直接電化學(xué)研究已成為生物電化學(xué)研究最重要的發(fā)展方向之一,1-5葡萄糖氧化酶(GOD)是一個(gè)具有剛性結(jié)構(gòu)的氧化還原酶,由兩條相同的多肽鏈組成的二聚體分子構(gòu)成,每條肽鏈中包含一個(gè)氧化還原中心——黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2),6具有較高的催化活性和高度的穩(wěn)定性,成為生物電化學(xué)研究領(lǐng)域中的一種理想的酶;所以將GOD用合適的方法固定在電極表面作為催化劑己得到廣泛關(guān)注.7-11而具有良好的導(dǎo)電性能和生物性能的酶載體研究,是酶的直接電化學(xué)的研究重點(diǎn).12-18影響酶在電極上的直接電化學(xué)性能行為因素主要有兩方面:一是電極上載體的空間結(jié)構(gòu),大小匹配的空間結(jié)構(gòu)可以使蛋白質(zhì)進(jìn)入到相應(yīng)的位置中,保持合適的二級(jí)結(jié)構(gòu),從而完成電子的直接轉(zhuǎn)移;二是載體的導(dǎo)電率,具有良好電子導(dǎo)電的載體能夠在蛋白質(zhì)和電極之間提供良好的電子通道,研究發(fā)現(xiàn)如果直接將酶吸附在平面型載體上,其電化學(xué)性能不好,但是如果是粗糙表面,其電化學(xué)性能則發(fā)生明顯改善.

炭氣凝膠是一種新型輕質(zhì)納米多孔無(wú)定形炭素材料,具有導(dǎo)電性好、多孔結(jié)構(gòu)等性能,被廣泛應(yīng)用于催化劑載體研究,19,20將炭氣凝膠應(yīng)用于葡萄糖生物傳感器中,可表現(xiàn)出較高的靈敏性、抗干擾性和較好的穩(wěn)定性,目前納米介孔炭氣凝膠固定葡萄糖氧化酶的直接電化學(xué)研究尚未見(jiàn)報(bào)道.以介孔炭氣凝膠為電極催化劑載體材料固定葡萄糖氧化酶,一方面利用納米介孔材料實(shí)現(xiàn)酶催化劑的高表面原子分布進(jìn)而提高傳統(tǒng)催化劑的活性,另一方面酶與電極之間直接電子傳遞過(guò)程更接近生物氧化還原的原始模型,用電極充當(dāng)電子的給予體或接受體,可以模擬生物體系電子傳遞機(jī)理,對(duì)了解生物分子的結(jié)構(gòu)和各種物理化學(xué)性質(zhì)具有重要的意義.本研究利用間苯二酚和甲醛在堿性環(huán)境下制備炭氣凝膠,用其固定葡萄糖氧化酶修飾玻碳電極,在無(wú)電子媒介體的情況下,研究其直接電化學(xué)性能以及對(duì)葡萄糖的催化性能.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑與儀器

葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4,from Asperillus niger,147 units·mg-1,glucose oxidase,GOD)(Sigma公司);2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)Nafion溶液(美國(guó)Aldrich化學(xué)公司);緩沖溶液為0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(PBS).其余試劑均為分析純?cè)噭?實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.葡萄糖儲(chǔ)備溶液在使用前24 h配制,以完成其構(gòu)型的轉(zhuǎn)換.

PB-10酸度計(jì)(德國(guó)賽多利斯公司);PARSTAT2273電化學(xué)分析工作站(美國(guó)PAR公司);HITACHI S-4300掃描電子顯微鏡(日本日立公司); BET(ASAP 2010型美國(guó)亞特蘭大Micromeritics Instrument Corporation);METTLER TOLEDO AL104-1C分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司); KQ-2200B超聲波清洗器(中國(guó)昆山市超聲儀器有限公司).

2.2 炭氣凝膠固定葡萄糖氧化酶修飾玻碳(GOD/CA/GC)電極的制備

利用間苯二酚和甲醛在堿性環(huán)境下制備炭氣凝膠(CA).21稱(chēng)取CA樣品10 mg,加入1 mL 95%(w)的乙醇中,超聲30 min后,再加入20 mg的GOD,機(jī)械搖勻,在4°C條件下放置24 h獲得GOD/CA懸濁液.稱(chēng)取CA樣品,用上述方法配置CA懸濁液.

將玻碳(GC)電極分別用粒徑為0.3和0.05 μm的氧化鋁漿打磨至光亮,在超聲狀態(tài)下依次用二次蒸餾水、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水清洗GC電極.干燥后用微量進(jìn)樣器分別取8 μL GOD/CA、CA懸濁液滴到不同的GC電極表面.半干后,再滴加2 μL 0.1%Nafion溶液,室溫下自然干燥,得到待測(cè)GOD/ CA/GC電極和CA/GC電極.

2.3 CA的結(jié)構(gòu)表征及GOD/CA/GC的電化學(xué)性能測(cè)試

采用HITACHI S-4300掃描電子顯微鏡觀(guān)察載體CA材料的表面形貌;BET測(cè)試在Micromeritics ASAP 2010(美國(guó)麥克儀器公司)上進(jìn)行;傅里葉紅外(FTIR)光譜測(cè)量在Nicolet 360 FTIR紅外光譜儀上進(jìn)行.電化學(xué)測(cè)試在室溫下進(jìn)行,采用三電極系統(tǒng):鉑電極作為對(duì)電極,飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極,分別以CA/GC、GOD/CA/GC電極(直徑4 mm)為工作電極.在pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的PBS中測(cè)定GOD/CA/GC的循環(huán)伏安曲線(xiàn).循環(huán)伏安掃描的電壓范圍為-0.68 V至-0.28 V(vs SCE).利用循環(huán)伏安法在pH=7.0的緩沖體系中測(cè)定不同葡萄糖濃度中GOD/CA/GC電極對(duì)葡萄糖的催化性能.

3 結(jié)果與討論

3.1 CA表面結(jié)構(gòu)分析

圖1 載體材料CA的SEM圖Fig.1 SEM image of carrier material CA

圖2 載體材料CA的TEM圖Fig.2 TEM image of carrier material CA

圖1給出了利用間苯二酚和甲醛在堿性環(huán)境下制備的炭氣凝膠(CA)載體材料的SEM圖,放大倍數(shù)為50000倍,從中可以看到炭氣凝膠載體表面為顆粒堆積形貌,顆粒大小約為200 nm,該表面可形成較大的比表面積從而有利于酶的附著.圖2為CA載體材料的TEM圖,從圖中可以看出樣品具有高度有序的微孔道結(jié)構(gòu),它們是由許多球狀的介孔籠通過(guò)窗口相互連接排列而成.

圖3為CA載體材料的N2吸脫附等溫線(xiàn)和孔徑分布圖,可以看出CA載體材料的N2吸脫附等溫線(xiàn)中有典型的IV型等溫線(xiàn)并伴隨有一個(gè)較明顯的滯后環(huán),表明CA載體材料有介孔結(jié)構(gòu)存在.孔徑分布圖表明孔徑分布范圍主要集中在10 nm左右,與GOD的尺寸(7-8 nm)相接近,BET的測(cè)試結(jié)果表明CA載體材料比表面積為586 m2·g-1,大小匹配的介孔結(jié)構(gòu)和較大的比表面積均有利于吸附固定GOD.圖4為CA載酶前后的氮吸脫附等溫曲線(xiàn)的對(duì)比圖,可以看出CA在固定葡萄糖氧化酶后與固定前的N2吸脫附曲線(xiàn)相比有明顯改變，載酶后N2的吸附量明顯降低,比表面積的測(cè)試結(jié)果為80 m2·g-1，表明GOD已固定到載體CA上.22

圖3 CA的氮吸脫附等溫曲線(xiàn)(A)和孔徑分布圖(B)Fig.3 N2adsorption-desorption isotherm(A)and pore size distribution curve(B)of CA

圖4 CA載酶前(A)和載酶后(B)氮吸脫附等溫曲線(xiàn)Fig.4 N2adsorption-desorption isotherms of CAbefore (A)and after(B)impregnation with GOD

圖5為CA、GOD、GOD/CA的紅外吸收光譜圖.在蛋白質(zhì)的紅外光譜中,酰胺I和酰胺II是蛋白質(zhì)肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征吸收,酰胺I是蛋白質(zhì)肽鏈骨架上C―O伸縮振動(dòng)引起的,酰胺II則是N―H面內(nèi)彎曲和C―N伸縮振動(dòng)共同引起的,根據(jù)酰胺I和酰胺II的峰位置的變化可以判斷蛋白質(zhì)是否變性.22其中GOD的紅外吸收光譜在1649和1538 cm-1處的吸收峰分別對(duì)應(yīng)的是GOD的酰胺I和酰胺II,在1105 cm-1處對(duì)應(yīng)的是GOD上C―O鍵的伸縮振動(dòng);GOD/ CA的紅外吸收光譜在1635和1540 cm-1處仍有較強(qiáng)的吸收峰對(duì)應(yīng)GOD的酰胺I和酰胺II,在1119 cm-1處吸收峰對(duì)應(yīng)GOD上C―O鍵的伸縮振動(dòng),可以看出,用該種方法固定GOD保持了其天然構(gòu)象.

圖5 CA、GOD和GOD/CA的紅外吸收光譜圖Fig.5 IR spectra of the samples CA,GOD,and GOD/CA

3.2 GOD/CA/GC電極的直接電化學(xué)研究

圖6為CA/GC和GOD/CA/GC電極在pH=7.0的磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線(xiàn)(CV),從圖中可以看出CA/GC電極在掃描電位范圍內(nèi)沒(méi)有任何可觀(guān)察到的電化學(xué)反應(yīng)發(fā)生,而GOD/CA/GC電極在-471和-512 mV(vs SCE)出現(xiàn)了一對(duì)明顯的氧化還原峰,其式量電位E0?為-491.5 mV,峰電位差ΔEp為41 mV,顯示了GOD在電極表面快的電子傳遞和良好的可逆性,表明GOD很好地固定在電極上,保持了很好的電化學(xué)活性.

圖6 CA/GC和GOD/CA/GC電極在0.1 mol·L-1 PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安曲線(xiàn)Fig.6 Cyclic voltammograms of CA/GC and GOD/CA/ GC electrodes at a solution of 0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0) PBS:phosphate buffered solution

圖7 (A)GOD/CA/GC電極在不同掃描速率(v)下的循環(huán)伏安曲線(xiàn)和(B)GOD/CA/GC電極陰極、陽(yáng)極峰電流與掃描速率的線(xiàn)性關(guān)系Fig.7 (A)Cyclic voltammograms of the GOD/CA/GC electrode at different scan rates(v);(B)plots of the redox peak currents vs scan rate

圖7A為GOD/CA/GC電極在不同掃描速率下得到的CV,可以看出峰電流隨掃描速率的增大而增大,電極電流與掃描速率呈線(xiàn)性關(guān)系(見(jiàn)圖7B),說(shuō)明GOD的電化學(xué)反應(yīng)受表面控制,23表明GOD很好地固定在CA/GC電極表面.隨著掃描速率的增加,陽(yáng)極、陰極峰電位分別向正、負(fù)方向產(chǎn)生較小的偏移,ΔEp增加,但E0?幾乎不變.由Laviron公式:24Ks= mnFv/RT(Ks:電子轉(zhuǎn)移速率,s-1;m:與峰電位差相關(guān)的參數(shù);n:電子轉(zhuǎn)移數(shù);F:法拉第常數(shù),96485 C· mol-1;v:掃描速率,mV·s-1;R:氣體常數(shù),J·mol-1· K-1;T:熱力學(xué)溫度,K)可計(jì)算出GOD/CA/GC電極的Ks約為5.72 s-1,與已報(bào)道文獻(xiàn)數(shù)據(jù)22,25,26相比該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GOD/CA/GC電極具有較高的電子轉(zhuǎn)移速率,說(shuō)明GOD/CA/GC電極上固定的GOD具有較快的電子傳遞過(guò)程,CA/GC電極表面的微環(huán)境更有利于GOD的直接電子轉(zhuǎn)移.

圖8A為GOD/CA/GC電極在不同pH值下的循環(huán)伏安曲線(xiàn).GOD/CA/GC電極的CV行為在很大程度上受溶液pH值的影響.溶液pH值的增加通常會(huì)導(dǎo)致其CV還原氧化峰電位的負(fù)移,從圖8B式量電位與pH值的關(guān)系中可以看出,在pH=6.0-8.0范圍內(nèi),電位(單位為V)隨著pH值的變化而線(xiàn)性變化,且線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)R=0.99453,求得其斜率為66.68,與公式E0?=constant+0.059pH中的理論值(59)24非常接近.表明該GOD/CA/GC電極上發(fā)生了直接電化學(xué)反應(yīng):GOD-FAD+2e-+2H+=GOD-FADH2,FAD為黃素腺嘌呤二核苷酸,該反應(yīng)伴隨有兩電子兩質(zhì)子的轉(zhuǎn)移,且GOD在電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)具有較好的可逆性.

圖8 (A)GOD/CA/GC電極在不同pH值下循環(huán)伏安曲線(xiàn)和(B)式量電位與pH值的關(guān)系圖Fig.8 (A)Cyclic voltammograms of GOD/CA/GC electrode at various pH values;(B)plot of E0?of GOD/CA/GC vs pH value of the solution

Nafion是一種很好的固定膜,但對(duì)于電子的傳遞有一定的阻礙作用,對(duì)于GOD/CA/GC電極,在Nafion質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、0.2%、0.1%,PBS濃度為0.1 mol·L-1、掃描速率為100 mV·s-1的條件下進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試,結(jié)果見(jiàn)圖9.從圖中可以看出隨Nafion濃度的減小,ΔEp值減小;通過(guò)計(jì)算得到三種Nafion質(zhì)量分?jǐn)?shù)下Ks依次為1.52,2.96,3.02 s-1,結(jié)果表明選擇低濃度的Nafion有利于電子的傳遞.但濃度進(jìn)一步的降低造成測(cè)試過(guò)程中活性物質(zhì)脫落.

3.3 GOD/CA/GC電極對(duì)葡萄糖的催化性能研究

圖10為GOD/CA/GC電極在不含葡萄糖溶液和含有5 mmol·L-1葡萄糖溶液pH為7的0.1 mol· L-1PBS溶液中100 mV·s-1下的循環(huán)伏安曲線(xiàn)圖.由圖可見(jiàn),向PBS中加入葡萄糖溶液后還原峰電流的絕對(duì)值明顯減小,而氧化峰電流明顯增加,這表明電極上的葡萄糖氧化酶與葡萄糖之間發(fā)生了酶催化反應(yīng),其反應(yīng)表達(dá)式為:

圖9 GOD/CA/GC電極使用不同濃度Nafion(w)的循環(huán)伏安圖Fig.9 Cyclic voltammograms of GOD/CA/GC electrode with different concentrations(w)of Nafion v=100 mV·s-1

圖10 GOD/CA/GCE在不含葡萄糖溶液(a)和葡萄糖濃度為5 mmol·L-1的溶液(b)中的循環(huán)伏安圖Fig.10 Cyclic voltammograms of GOD/CA/GCE in absence(a)and presence(b)of 5 mmol·L-1glucose solution conditions:0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0),v=100 mV·s-1

圖11A為GOD/CA/GC電極對(duì)葡萄糖的催化性能測(cè)試,從圖中可以看出,當(dāng)連續(xù)加入濃度為0.4 mmol·L-1的葡萄糖溶液時(shí),電流響應(yīng)出現(xiàn)跳躍性增大,電極的電流響應(yīng)時(shí)間小于10 s.隨著葡萄糖的濃度增大,可以觀(guān)察到電極響應(yīng)出現(xiàn)了一個(gè)飽和平臺(tái),說(shuō)明此電極反應(yīng)具有典型的Michaelis-Menten酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征.圖11B為電流響應(yīng)值與葡萄糖濃度的關(guān)系圖,二者在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性范圍為0.4-2.0 mmol·L-1,線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.99114.由圖可以得到該電極的靈敏度約為5.33 μA·mmol-1·cm-2,當(dāng)信噪比為3時(shí),電極檢測(cè)限為0.266 mmol·L-1.結(jié)果表明GOD/CA/GC電極具有較高的靈敏度和較低檢測(cè)限.

圖11 GOD/CA/GC電極對(duì)葡萄糖的催化性能圖(A)與電流響應(yīng)值與葡萄糖濃度的關(guān)系(B)Fig.11 Amperometric response of GOD/CA/GC electrode during successive addition of glucose(A)and plots of chronoamperometric current vs glucose concentration(B) conditions:0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0),potential of-480 mV

圖12為干擾物對(duì)GOD/CA/GC電極催化葡萄糖性能影響的測(cè)試結(jié)果,從圖中可以看出,加入濃度為0.8 mmol·L-1的葡萄糖溶液時(shí)有電流響應(yīng),而當(dāng)分別加入濃度均為0.08 mmol·L-1的抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)和多巴胺(DP)時(shí),電流基本沒(méi)有受到影響,表明該電極具有很好的抗干擾性.27

圖12 干擾物對(duì)GOD/CA/GC電極催化葡萄糖性能的影響Fig.12 Effect of interfering species on response of GOD/CA/GC eletrode to glucose interfering species dissolved in 0.1 mol·L-1PBS(pH=7.0),at potential of-480 mV;AA:ascorbic acid,UA:uric acid,DP:dopamine

為了考察GOD/CA/GC電極的重現(xiàn)性,用6根不同的玻碳電極,分別固定GOD/CA,CV測(cè)定結(jié)果為6條曲線(xiàn)幾乎重合,說(shuō)明該電極有很好的重現(xiàn)性;在緩沖溶液中,將電極在100 mV·s-1的掃描速率下連續(xù)掃描90圈,其循環(huán)伏安曲線(xiàn)基本保持不變,工作穩(wěn)定性很好;將GOD/CA/GC電極放在4°C冰箱中保存2天后在緩沖溶液中再次測(cè)定其對(duì)葡萄糖的催化活性,發(fā)現(xiàn)CV曲線(xiàn)中的電催化電流并沒(méi)有明顯的改變,這說(shuō)明GOD/CA/GC電極具有很好的貯存穩(wěn)定性.

4 結(jié)論

表面結(jié)構(gòu)和孔徑分布結(jié)果表明,CA載體材料具有與葡萄糖氧化酶大小相匹配的介孔結(jié)構(gòu)和較大的表面積,該結(jié)構(gòu)有利于酶的負(fù)載.以CA載體采用吸附法得到GOD/CA/GC電極,該電極在磷酸鹽緩沖溶液中的循環(huán)伏安曲線(xiàn)說(shuō)明,CA載體可以很好地固定GOD并保持其生物活性,且氧化還原峰的電流與掃描速率呈線(xiàn)性關(guān)系,說(shuō)明電極反應(yīng)受表面控制;GOD/CA/GC電極在不同pH值下循環(huán)伏安曲線(xiàn)分析結(jié)果表明,GOD在電極上實(shí)現(xiàn)了直接電子轉(zhuǎn)移;I-t曲線(xiàn)表明,GOD/CA/GC電極對(duì)葡萄糖具有良好的催化性能并表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性.

(1) Qian,J.Q.;Yan,S.C.;Xiao,Z.D.J.Colloid Interface Sci. 2012,366(1),130.doi:10.1016/j.jcis.2011.09.082

(2)Alwarappan,S.;Boyapalle,S.;Kumar,A.;Li,C.Z.;Mohapatra, S.J.Phys.Chem.C 2012,116(11),6556.doi:10.1021/ jp211201b

(3) Gu,T.;Zhang,Y.;Deng,F.;Zhang,J.;Hasebe,Y.J.Environ. Sci.2011,23(Supplement),S66.

(4) Vasylieva,N.;Barnych,B.;Meiller,A.;Maocler,C.;Pollegioni, L.;Lin,J.S.;Barbier,D.;Marinesco,S.Biosens.Bioelectron. 2011,26(10),3993.doi:10.1016/j.bios.2011.03.012

(5)Guo,C.X.;Li,C.M.Phys.Chem.Chem.Phys.2010,12(38), 12153.

(6) Hecht,H.J.;Kalisz,H.M.;Hendle,J.;Schmid,R.D.; Schomburg,D.J.Mol.Biol.1993,229(1),153.doi:10.1006/ jmbi.1993.1015

(7)Ma,G.X.;Zhong,H.;Lu,T.H.;Xia,Y.Y.Acta Phys.-Chim. Sin.2007,23(7),1053. [馬國(guó)仙,仲 慧,陸天虹,夏永姚.物理化學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(7),1053.]doi:10.3866/PKU. WHXB20070717

(8) Chen,Z.C.;Xu,S.H.;Lin,H.F.;Yang,S.M.;Lin,X.F.Acta Phys.-Chim.Sin.2004,20(10),1267.[陳志春,徐善浩,林漢楓,楊紹明,林賢福.物理化學(xué)學(xué)報(bào),2004,20(10),1267.]doi: 10.3866/PKU.WHXB20041021

(9)Guo,X.L.;Guo,M.;Wang,X.D.Acta Phys.-Chim.Sin.2007, 23(4),585.[郭小麗,郭 敏,王新東.物理化學(xué)學(xué)報(bào),2007, 23(4),585.]doi:10.3866/PKU.WHXB20070426

(10)Yang,Z.J.;Huang,X.C.;Zhang,R.C.;Li,J.;Xu,Q.;Hu,X.Y. Electrochim.Acta 2012,70,325.

(11)Luo,Z.M.;Yuwen,L.H.;Han,Y.J.;Tian,J.;Zhu,X.R.;Weng, L.X.;Wang,L.H.Biosens.Bioelectron.2012,36(1),179.doi: 10.1016/j.bios.2012.04.009

(12)Tsai,T.W.;Heckert,G.;Neves,L.F.;Tan,Y.Q.;Kao,D.Y.; Harrison,R.G.;Resasco,D.E.;Schmidtke,D.W.Anal.Chem. 2009,81(19),7917.doi:10.1021/ac900650r

(13)Kang,X.H.;Wang,J.;Wu,H.;Aksayet,I.A.;Liu,J.;Lin,Y.H. Biosens.Bioelectron.2009,25(4),901.doi:10.1016/j. bios.2009.09.004

(14) Xu,X.;Jiang,S.;Hu,Z.;Liu,S.Q.ACS Nano 2010,4(7), 4292.doi:10.1021/nn1010057

(15)Wang,Y.;Yuan,R.;Chaia,Y.;Li,W.J.;Zhuo,Y.;Yuan,Y.L.; Li,J.J.J.Mol.Catal.B:Enzym.2011,71(3-4),146.doi: 10.1016/j.molcatb.2011.04.011

(16)You,C.;Xu,X.;Tian,B.;Kong,J.L.;Zhao,D.Y.;Liu,B.H. Talanta 2009,78(3),705.doi:10.1016/j.talanta.2008.12.032

(17)You,C.;Yan,X.;Kong,J.;Zhao,D.Y.;Liu,B.H.Talanta 2011, 83(5),1507.doi:10.1016/j.talanta.2010.11.041

(18) Patil,D.;Dung,N.Q.;Jung,H.;Ahn,S.Y.;Jang,D.M.;Kim, D.Biosens.Bioelectron.2012,31(1),176.doi:10.1016/j. bios.2011.10.013

(19) Moreno-Castilla,C.;Maldonado-Hodar,F.J.Carbon 2005,43 (3),455.doi:10.1016/j.carbon.2004.10.022

(20)Zhu,H.;Guo,Z.;Zhang,X.;Han,K.F.;Guo,Y.B.;Wang,F. H.;Wang,Z.M.;Wei,Y.S.Int.J.Hydrog.Energy 2012,37(1), 873.doi:10.1016/j.ijhydene.2011.04.032

(21) Pekala,R.W.J.Mater.Sci.1989,24(9),3221.

(22) Wu,S.;Ju,H.;Liu,Y.Adv.Funct.Mater.2007,17(4),585.

(23) Bao,S.J.;Li,C.M.;Zang,J.F.;Cui,X.Q.;Qiao,T.;Guo,J. Adv.Funct.Mater.2008,18(4),591.

(24) Laviron,J.Electroanal.Chem.1979,101(1),19.doi:10.1016/ S0022-0728(79)80075-3

(25) Ivnitski,D.;Artyushkova,K.;Rincon,R.A.;Atanassov,R.P.; Luckarift,H.R.;Johnson,G.R.Small 2008,4(3),357.

(26) Janegitz,B.C.;Pauliukaite,R.;Ghica,M.E.;Brettb,C.B.A.; Fatibello-Filho,O.Sens.Actuators B 2011,158(1),411.doi: 10.1016/j.snb.2011.06.048

(27) Meng,L.;Jin,J.;Yang,G.X.;Lu,T.H.;Zhang,H.;Cai,C.X. Anal.Chem.2009,81(17),7271.doi:10.1021/ac901005p