郭偉男 孫麗敏 鄭小霞 張鍾元 李夢軒 翟雨佳 張成順

子宮內(nèi)膜息肉(EP)是良性內(nèi)膜腺體和纖維性間質(zhì)組成的瘤樣病變，在青春期后的任何年齡均可發(fā)生，多數(shù)發(fā)生在35歲以后，以絕經(jīng)前后為發(fā)病的高峰，可引起異常子宮出血、不育等。文獻(xiàn)報道其患病率為24%～25%［1］。3.3%的EP可發(fā)生癌前病變，3.0%可發(fā)生惡變，特別是絕經(jīng)后EP患者的惡變率更高［2］。目前，EP的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。本實驗通過檢測子宮內(nèi)膜息肉及正常增殖期子宮內(nèi)膜中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(GLUT-1)的表達(dá)，探討子宮內(nèi)膜息肉形成的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2010年8月就診于我院門診宮腔鏡檢查，并檢出EP的已婚女性38例為病例組，其中置宮內(nèi)節(jié)育器(不含激素及抗炎藥物)13例，年齡25～46歲;近3個月未用任何甾體激素類藥物;排除生殖器官畸形、合并肝腎等慢性疾病的患者。選取同期因生殖道畸形而行宮腔鏡檢查的女性，月經(jīng)規(guī)律，刮取少量子宮內(nèi)膜作為對照組，共19例(患者知情并同意)。以上標(biāo)本均取自月經(jīng)干凈后3～7 d，術(shù)后分別經(jīng)病理證實為EP和增生期子宮內(nèi)膜。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集:用0.9%氯化鈉溶液清洗經(jīng)宮腔鏡剪取的子宮內(nèi)膜及息肉組織后迅速投入液氮中保存。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，取5 μl經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測完整性。

1.2.2 cDNA合成:將RNA模板10 μl、引物1 μl混勻置于70℃水浴5 min，后冰浴30 s，再加入二硫蘇糖醇(DTT)5 μl、5×緩沖液10 μl、核糖核酸酶抑制劑(RNase Inhibitor)0.5 μl、三磷酸脫氧核苷(dNTP)2 μl、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl和雙氧水21 μl，30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min。1.2.3 引物:ER引物:上游5’-GGAGACATGAGAGCTGCCA-3’下游5’-CCAGCAGCATGTCGAAGATC-3’目的片段長度為438bp;PR引物:上游5’-TCATGAGCCGGTCCGGGTGCAAG-3’，下游5’-CGGGGTGGACGAGGCACAGG-3’，目的片段長度為196bp;GLUT-1引物:上游5’-TCATCGTGGCTGAACTCTTCAG-3’下游5’-TCACACTTGGGAATCAGCCCC-3’，目的片段長度為231bp;β-actin引物:Actb-F:5’-TACCCAGGCATTGCTGACAGG-3’，Actb-R:5’-ACTTGCGGT GCACGATGGA-3’，目的片段長度205bp。

1.2.4 PCR擴(kuò)增:擴(kuò)增體系包括:上下游引物:2.5 μl、逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA):1 μl、dNTP(2 mmol/L):1 μl、Buffer:2 μl、ddH2O:14.85 μl，共25 μl。

ER擴(kuò)增條件:95℃ 預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、53℃退火30 s、72℃30 s，72℃ 延伸5 min，30個循環(huán)，4℃保存;PR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)，95℃變性45 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，30個循環(huán)后72℃最后延伸5 min，4℃保存;GLUT-1擴(kuò)增條件:94℃ 預(yù)變性5 min，92℃變性:30 s，63℃退火:30 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)后72℃最后延伸7 min，4℃保存。

1.2.5 產(chǎn)物分析:紫外透射儀上觀察結(jié)果并照相，選用Band-Scan5.0凝膠圖像處理軟件進(jìn)行光密度值分析，采用目的基因與β-actin光密度的比值表示目的基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以ˉx±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 2組RT-PCR檢測ER、PR、Glut-1轉(zhuǎn)錄水平1、2為對照組;3、4為病例組

2 結(jié)果

對照組 ER與 GLUT-1的表達(dá)明顯低于病例組(P＜0.05)，PR的表達(dá)高于病例組(P＜0.05)。見表1。

表1 2組ER、PR及GLUT-1表達(dá)比較 ±s

表1 2組ER、PR及GLUT-1表達(dá)比較 ±s

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別ER PR GLUT-1對照組(n=19)0.734±0.302 0.768±0.205 0.342±0.035病例組(n=38) 1.253±0.305* 0.421±0.107* 0.843±0.105*

3 討論

雌激素通過與ER結(jié)合，形成二聚體，再通過與靶基因中的雌激素反應(yīng)元件(ERE)特異性結(jié)合，形成細(xì)胞信號刺激靶基因轉(zhuǎn)錄，造成一系列促進(jìn)靶器官細(xì)胞增殖和分化的蛋白表達(dá)，對子宮內(nèi)膜作用即表現(xiàn)為促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增生和血管增殖［3，4］。此外雌激素通過正反饋作用還可以在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)ER和PR生成，長期過度的作用即可使子宮內(nèi)膜發(fā)生增生甚至癌變，而增生的一個表現(xiàn)即為形成子宮內(nèi)膜息肉。近年來在對育齡女性的研究中發(fā)現(xiàn)，并非ER、PR都參與了子宮內(nèi)膜息肉的形成，雌激素在其中起著更為重要的作用［5］，而孕激素在息肉中的表達(dá)降低，對本病發(fā)生起保護(hù)作用。當(dāng)內(nèi)分泌功能出現(xiàn)紊亂時，雌、孕激素的水平及時相異常，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜ER、PR表達(dá)發(fā)生差異，不同部位內(nèi)膜性激素受體表達(dá)不平衡，使內(nèi)膜對雌、孕激素反應(yīng)不一致，各處子宮內(nèi)膜增生不平衡，ER表達(dá)較高的內(nèi)膜可在雌激素的刺激下過度增生［6］。

Glut是哺乳動物細(xì)胞葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，主要負(fù)責(zé)葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的生理過程，其家族共有13個成員:GLUT1-12和HMIT，不同組織中可表達(dá)不同分型的GLUT。許多研究表明，不典型增生組織和癌組織中，GLUT-1的表達(dá)普遍增強(qiáng)，而且其表達(dá)強(qiáng)度與細(xì)胞的增殖程度相關(guān)［7］?？梢哉fGLUT家族是細(xì)胞耗能的一個標(biāo)志，其表達(dá)增高可能預(yù)示著細(xì)胞異常分裂增生而需要大量葡萄糖作為基礎(chǔ)供能。有文獻(xiàn)報道，單純性、復(fù)雜性增生子宮內(nèi)膜與不典型增生子宮內(nèi)膜的GLUT-1表達(dá)有差異，提示GLUT-1可以區(qū)分良性子宮內(nèi)膜和具有惡性傾向的不典型增生子宮內(nèi)膜，并認(rèn)為GLUT-1異常表達(dá)可能是組織惡性轉(zhuǎn)化中的早期事件［8］。

在子宮內(nèi)膜息肉組織中，ER和GLUT-1表達(dá)升高，PR表達(dá)降低，提示ER、PR和GLUT-1在子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，為今后以ER、PR和GLUT-1為靶點的臨床基因治療子宮內(nèi)膜息肉提供新的重要對策。

.Current practice for

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