枊福智，藺海明，李占強(qiáng)，張漢平

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.酒泉甘草生物育種研究所，甘肅 酒泉 735000)

甘草(Glycurrihizauralensis)是豆科甘草屬多年生草本植物，以根和根莖入藥[1],具補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳和調(diào)和諸藥等功效，是我國(guó)2 000多種草藥中用量最大的傳統(tǒng)中藥材之一。甘草不僅用于醫(yī)藥方面，而且在食品、日用化學(xué)品、煙草等行業(yè)也被廣泛應(yīng)用[2]。甘草根系發(fā)達(dá)，生命力強(qiáng)，是半干旱荒漠地區(qū)優(yōu)良的藥用和防風(fēng)固沙植物[3];具有抗寒、耐旱、抗鹽堿、固沙和改良土壤等作用，對(duì)防止水土流失和改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義。甘草廣泛分布于我國(guó)西北干旱的溫帶荒漠和溫帶草原區(qū)域[4]。近年來，隨著國(guó)內(nèi)和國(guó)際市場(chǎng)需求的不斷增加，野生資源被過度采挖，致使甘草質(zhì)量和產(chǎn)量下降，種質(zhì)資源遭到嚴(yán)重破壞[5]。甘草從播種到成功結(jié)實(shí)周期較長(zhǎng)，至少需要4～5年，種子繁育緩慢已成為制約甘草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸[6]。為解決這一矛盾，很多研究者采用基因工程和組織培養(yǎng)技術(shù)開展工作，為野生甘草資源的保護(hù)和新品種選育提供了新途徑。對(duì)于甘草種苗和組培技術(shù)研究，Zheng等[7]研究了鎘對(duì)甘草種苗生長(zhǎng)和抗氧化劑的影響；劉昕等[8]對(duì)脹果甘草(G.inflata)愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率進(jìn)行了研究；陳巍等[9]對(duì)下胚軸、根尖和根中部進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)的研究。營(yíng)養(yǎng)元素在愈傷組織的生長(zhǎng)過程中起著很重要的作用，但有關(guān)不同外植體和不同濃度的氮源對(duì)甘草愈傷組織生長(zhǎng)的影響研究相對(duì)較少。本研究以甘草無菌苗的不同外植體為材料，研究不同外植體及氮源對(duì)甘草愈傷組織誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)狀況的影響，旨在選擇誘導(dǎo)甘草愈傷組織的最佳外植體和氮源濃度，為甘草優(yōu)質(zhì)苗的工廠化快速繁殖提供理論及技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料 以烏拉爾甘草無菌苗的下胚軸、莖、子葉、胚根為試驗(yàn)材料。

1.2方法

1.2.1無菌苗的獲得 選取優(yōu)質(zhì)的烏拉爾甘草種子，用自來水充分清洗，然后用75%乙醇滅菌30 s，無菌水沖洗3次，0.1%氯化汞常規(guī)滅菌10～15 min，無菌水沖洗3次，然后用滅菌濾紙吸干種子表面的水分，將種子接到MS培養(yǎng)基上，pH值5.8，培養(yǎng)室溫度28 ℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx，每天光照時(shí)間為12～14 h，培養(yǎng)室濕度為70%左右，培養(yǎng)25 d左右可得甘草無菌苗。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo) 采用培養(yǎng)出的烏拉爾甘草無菌苗的胚根、莖、子葉、下胚軸為外植體材料，接種于前期優(yōu)選的最佳激素組合MS+6-BA 0.6 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1上[6]，瓊脂5 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，培養(yǎng)基的pH值5.8。每個(gè)處理20瓶，于高溫、高壓下滅菌30 min，恒溫放置12 h后接種。等愈傷組織誘導(dǎo)出后，每隔5 d測(cè)定一次愈傷組織的鮮質(zhì)量，觀察和記錄外植體形成不同顏色的愈傷組織數(shù)目，并計(jì)算每種顏色愈傷組織所占的比例。

1.2.3氮源濃度對(duì)甘草愈傷組織誘導(dǎo)影響的測(cè)定 以甘草無菌苗下胚軸為外植體，接種于含不同氮源濃度的MS+6-BA 0.6 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1培養(yǎng)基上，氮源為KNO3和NH4NO3的總濃度(KNO3∶NH4NO3=1∶1)，設(shè)6個(gè)處理，濃度分別為0、60、120、180、240、300 mmol·L-1。每個(gè)處理做20瓶，重復(fù)3次。每2 d觀察一次，記錄下胚軸出愈個(gè)數(shù)，計(jì)算誘導(dǎo)率。

1.2.4愈傷組織誘導(dǎo)率的計(jì)算方法

1.3統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1不同外植體對(duì)出愈率的影響 在相同的培養(yǎng)條件下，外植體不同，誘導(dǎo)率也不同，且差別較大(圖1)。在接種數(shù)相同的情況下，愈傷組織誘導(dǎo)率的差異較為明顯，其中下胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，莖的愈傷組織率最低。經(jīng)方差分析，不同外植體誘導(dǎo)率均差異顯著(P<0.05)，由試驗(yàn)結(jié)果可知，4種外植體愈傷組織誘導(dǎo)率以下胚軸最高(93.9%)，之后依次是子葉(79.5%)、胚根(73.9%)、莖(65.5%)。

2.2不同外植體對(duì)愈傷組織顏色的影響 4種不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中淡黃色占的比例較高(表1)，其中胚根為44.4%，莖為33.5%，子葉為56.2%，下胚軸為68.4%。4種不同外植體中，莖誘導(dǎo)出的愈傷組織的褐化率最高，為20.0%，下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織的褐化率最低，為5.6%。

圖1 不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

4種不同外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織中，呈現(xiàn)黃綠色和乳白色最多的分別為莖和胚根，分別為33.4%和27.8%。經(jīng)方差分析，胚根和下胚軸各顏色愈傷組織占愈傷組織總數(shù)的比例差異顯著(P<0.05)。從愈傷組織生長(zhǎng)狀況來看，莖和胚根誘導(dǎo)出的愈傷組織松散，而且生長(zhǎng)緩慢，較易褐化；子葉不易誘導(dǎo)愈傷組織，而且生長(zhǎng)緩慢，質(zhì)地較差；下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織生長(zhǎng)快，愈傷組織呈現(xiàn)顆粒狀，質(zhì)地軟硬適宜，誘導(dǎo)率高，生長(zhǎng)好。因此，下胚軸是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。

表1 不同顏色愈傷組織占愈傷組織總數(shù)的比例

2.3不同外植體對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)狀況的影響 甘草愈傷組織生長(zhǎng)呈“S”形變化，愈傷組織生長(zhǎng)的前10 d，其生長(zhǎng)比較緩慢；10～25 d，愈傷組織生長(zhǎng)迅速，其鮮質(zhì)量增加較快；25 d以后愈傷組織生長(zhǎng)趨于緩和(圖2)。下胚軸的愈傷組織生長(zhǎng)較快，其鮮質(zhì)量的生長(zhǎng)量均大于莖、子葉和胚根的愈傷組織生長(zhǎng)量。子葉形成的愈傷組織生長(zhǎng)比較緩慢，25 d以后愈傷組織生長(zhǎng)迅速，比莖和胚根形成的愈傷組織生長(zhǎng)快；愈傷組織鮮質(zhì)量明顯高于莖和胚根的愈傷組織生長(zhǎng)量。莖的愈傷組織從誘導(dǎo)形成到生長(zhǎng)至25 d，其生長(zhǎng)速度僅次于下胚軸，愈傷組織鮮質(zhì)量生長(zhǎng)量比子葉和胚根的要快，25 d以后愈傷組織生長(zhǎng)趨于緩慢。從愈傷組織生長(zhǎng)積累的變化可以看出，外植體對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)狀況有重要的影響，外植體不同，愈傷組織誘導(dǎo)的難易和生長(zhǎng)快慢各不相同。綜合愈傷組織的生長(zhǎng)狀況，下胚軸是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。

圖2 甘草愈傷組織鮮質(zhì)量變化曲線

在愈傷組織誘導(dǎo)的前10 d，不同外植體愈傷組織的平均日生長(zhǎng)速率比較緩慢(表2)，其中下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織平均日生長(zhǎng)速率最高，為7.66 mg·d-1；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織的平均生長(zhǎng)速率逐漸增加，生長(zhǎng)至15～20 d時(shí)，除子葉外，不同外植體的平均日生長(zhǎng)速率達(dá)到最大，其中下胚軸誘導(dǎo)出的愈傷組織平均日生長(zhǎng)速率最高，為19.06 mg·d-1；子葉誘導(dǎo)出的愈傷組織平均日生長(zhǎng)速率在20～25 d時(shí)最高，為19.46 mg·d-1；子葉形成愈傷組織平均日生長(zhǎng)速率比較緩慢。經(jīng)方差分析，不同外植體之間愈傷組織的平均日生長(zhǎng)率差異顯著 (P<0.05)。20 d以后除子葉外，其他外植體的愈傷組織平均生長(zhǎng)速率明顯下降。分析表明，下胚軸從誘導(dǎo)愈傷組織開始到20 d時(shí)平均日生長(zhǎng)率明顯高于其他外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織，所以下胚軸具有較高的生長(zhǎng)速率，是最佳的外植體。

2.4不同濃度的氮源對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 不同濃度的氮源對(duì)甘草下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響結(jié)果顯示(圖3)，氮源濃度對(duì)甘草下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)有明顯的影響。低濃度和高濃度的氮源均不利于愈傷組織的誘導(dǎo)，在氮源濃度為60 mmol·L-1時(shí)，從試驗(yàn)得知，培養(yǎng)9 d后，下胚軸周圍形成了大量的黃綠色的愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到了92.5%，隨著氮源濃度的升高愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸下降，且生長(zhǎng)速度減慢。在氮源濃度為300 mmol·L-1時(shí)，幾乎沒有愈傷組織產(chǎn)生，誘導(dǎo)率最低，為10.2%。這表明，最佳的氮源濃度是愈傷組織誘導(dǎo)成功與否的關(guān)鍵因素，經(jīng)方差分析，不同氮源濃度對(duì)下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率的影響均達(dá)到顯著差異(P<0.05)。

2.5不同濃度的氮源對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量積累的影響 愈傷組織鮮質(zhì)量呈“S”型變化(圖4)。甘草下胚軸在接種5 d時(shí)鮮質(zhì)量有所增加，是由于其接種到新鮮培養(yǎng)基上吸水膨脹的結(jié)果，接種10～20 d甘草愈傷組織鮮質(zhì)量增加最快，25 d以后愈傷組織鮮質(zhì)量的增加都趨于緩慢。氮源濃度為60mmol·L-1時(shí)，愈傷組織鮮質(zhì)量積累最快，達(dá)到9.15 mg·d-1；氮源濃度為300 mmol·L-1時(shí)，愈傷組織鮮質(zhì)量最小，為6.25 mg·d-1。由此可見，氮源濃度對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)量有明顯的影響，因此，適宜于甘草下胚軸愈傷組織生長(zhǎng)的最佳氮源濃度為60 mmol·L-1。

表2 不同外植體愈傷組織的階段生長(zhǎng)速率

圖3 氮源濃度對(duì)對(duì)下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

圖4 氮源濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量的影響

3 討論與結(jié)論

外植體是影響愈傷組織誘導(dǎo)的因素之一。各種外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織的難易及其所需求的條件有很大的不同，這與外植體供體的遺傳因素、基因型和外植體本身的生理生化狀態(tài)密切相關(guān)。同一種植物不同的組織和器官再生能力也有很大差異，本試驗(yàn)中，甘草的外植體不同，對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的影響不同，下胚軸是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體，愈傷組織生長(zhǎng)好且誘導(dǎo)率最高，子葉較不容易誘導(dǎo)愈傷組織，而且生長(zhǎng)比較緩慢且質(zhì)地較差；莖和胚根誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地松散，生長(zhǎng)較慢且易褐化；甘草不同外植體愈傷組織的生長(zhǎng)呈“S”型變化，愈傷組織在不同的生長(zhǎng)階段快慢程度不一。

本試驗(yàn)以甘草下胚軸為外植體誘導(dǎo)愈傷組織具有較高的誘導(dǎo)率和較好的生長(zhǎng)狀況，是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳外植體。該結(jié)論與范小峰等[10]以甘草的子葉、下胚軸及胚根為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)所得結(jié)論基本一致。根據(jù)細(xì)胞全能性理論，植物任何器官都可以用作外植體，但不同組織器官培養(yǎng)成功的難易程度是不同的[11]。在甘草不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的過程中可以得出，外植體不同，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響效應(yīng)不同。因此，如何選擇最佳外植體是愈傷組織能否高效誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素之一。

營(yíng)養(yǎng)元素在細(xì)胞培養(yǎng)中具有非常重要的作用。在離體條件下，植物細(xì)胞需要從培養(yǎng)基中攝取必需的營(yíng)養(yǎng)元素才能維持細(xì)胞正常的生理生化等一系列代謝過程，當(dāng)這些營(yíng)養(yǎng)元素以適當(dāng)?shù)臐舛却嬖跁r(shí)才有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生代謝物的積累。氮是細(xì)胞中核酸的組成成分，也是生物體許多酶的成分。氮被植物吸收利用后轉(zhuǎn)化為氨基酸，再轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)，然后被植物利用。氮源的種類和濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物合成的影響非常顯著[12]。本試驗(yàn)中，研究了不同濃度的氮源對(duì)甘草無菌苗的下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響，由結(jié)果可以看出，較低和較高濃度的氮源都不利于愈傷組織的生長(zhǎng)，適宜甘草下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)的最佳氮源濃度為60 mmol·L-1。愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)過程中受多種綜合因素的影響，因此，各種復(fù)雜因素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)和干物質(zhì)積累有待于更加深入的研究。

[1] 肖培根.新編中藥志(第一卷)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2002：259-277.

[2] 王巧餓，任紅，曹雪麗.甘草研究開發(fā)與利用現(xiàn)狀[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27(4)：290-295.

[3] 藺海明，紀(jì)英，邱黛玉.灌水對(duì)沙漠綠洲區(qū)甘草生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)和產(chǎn)量的影響[J].草業(yè)科學(xué)，2011，28(11)：1992-1997.

[4] 周應(yīng)群，陳士林，趙潤(rùn)懷.藥用甘草植物資源生態(tài)學(xué)研究[J].中草藥，2009，40(10)：1668.

[5] 魏勝利，王全文，王海.我國(guó)中西部地區(qū)甘草資源及其可持續(xù)利用的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2003，28(3)：202.

[6] 趙晶，柳福智，藺海明.不同外植體對(duì)甘草愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38(19)：36-38.

[7] Zheng G,Lv H P,Gao S,etal.Effects of cadmium on growth and antioxidant responsesinGlycyrrhizauralensisseedlings[J].Plant Soil Environment,2010,56(11):508-515.

[8] 劉昕，王清，于斌.不同外源激素對(duì)脹果甘草愈傷組織誘導(dǎo)及褐化的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(6):88-93.

[9] 陳巍，于泉林，高文遠(yuǎn)，等.甘草愈傷組織培養(yǎng)的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30(9)：713-715.

[10] 范小峰，楊穎麗，郭小強(qiáng)，等.烏拉爾甘草不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及影響因子研究[J].中藥材，2009，32(2)：173-176.

[11] 曹君邁，李強(qiáng)，王崇.烏拉爾甘草胚狀體的誘導(dǎo)及再生體系的建立[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2010，24(3)：522-526.

[12] Kim S H,Kim S K.Effect of nitrogen source on cell growth and anthocyanin production in callus and cell suspension culture of ‘Sheridan’ grapes[J].Journal of Plant Biotechnology,2002,4(2):83.