林辰壹，韓文娟，祁晨霞，葉 強(qiáng)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

植物雌雄蕊開(kāi)放過(guò)程中的形態(tài)變化特征與柱頭可授性和花粉育性密切相關(guān)，是植物長(zhǎng)期適應(yīng)生態(tài)環(huán)境變化、保障自身在自然條件下繁殖成功的進(jìn)化結(jié)果，對(duì)于異花授粉植物而言，花粉作為父本重要的基因流載體，與花粉育性一起決定了雄性親本的遺傳信息是否能夠傳遞給下一代[1]。對(duì)于蟲(chóng)媒花，雄蕊開(kāi)放中的形態(tài)和時(shí)空變化影響到傳粉昆蟲(chóng)的訪花頻率和時(shí)間，最終影響花粉的成功傳遞。因此，雄蕊的形態(tài)特征變化和花粉育性一直是植物繁殖生物學(xué)研究的基本點(diǎn)和出發(fā)點(diǎn)，是分析植物與傳粉者的關(guān)系、交配系統(tǒng)選擇的前提，是植物開(kāi)花生物學(xué)重要的組成部分[2]。

高葶韭(Alliumobliquum)在中國(guó)僅分布于新疆和布克賽爾、沙灣、伊寧等海拔1 200～2 000 m的山地草原和草甸帶中[3]，國(guó)外分布于俄羅斯、哈薩克斯坦、蒙古等國(guó)[4]。高葶韭是新疆干旱半干旱特殊環(huán)境下難得的早春野生蔬菜植物資源，一直以來(lái)被采集食用[5-6],在國(guó)外是重要的觀賞植物資源[7-8]，同時(shí)，高葶韭植物的乙醇溶液的提取物對(duì)Aspergillusniger、Botrytiscinerea、Fusariumoxysporumsp.gladioli、Penicilliumexpansum以及Sclerotiniasclerotiorum有很強(qiáng)的抑制作用，由于含有天然抑菌成分使其成為植物源性殺菌劑被重視[9]。研究新疆特殊地理環(huán)境條件下高葶韭與環(huán)境相適應(yīng)的生殖生長(zhǎng)特點(diǎn)，是摸清自然條件下高葶韭種質(zhì)資源繁殖規(guī)律過(guò)程中要解決的首要問(wèn)題。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)高葶韭雄蕊特征和花粉育性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀測(cè)高葶韭花期其雄蕊的開(kāi)放動(dòng)態(tài)，同時(shí)檢測(cè)花粉活力和花粉萌發(fā)率變化規(guī)律，以期為實(shí)現(xiàn)有效保護(hù)利用和人工繁育奠定基礎(chǔ)，為野生蔥屬植物資源繁育系統(tǒng)研究和種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1高葶韭雄蕊開(kāi)花動(dòng)態(tài)特征的觀察 高葶韭花期選擇總苞開(kāi)裂但小花尚未開(kāi)裂的單花觀察其開(kāi)花動(dòng)態(tài)。隨機(jī)掛牌標(biāo)記健康、長(zhǎng)勢(shì)均勻的、即將開(kāi)花的20 個(gè)花蕾，每天觀察一次直到單花開(kāi)放后每隔2 h觀察一次，記錄花朵的開(kāi)放進(jìn)程，直到花藥全部落去花被片閉合[10]。雄蕊特征觀察包括花絲及花藥兩部分。每次觀測(cè)時(shí)記錄雄蕊數(shù)目、形狀、顏色及雄蕊伸展的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化特征，同時(shí)，測(cè)定空氣的溫度和濕度?；ńz長(zhǎng)度測(cè)量時(shí)，選擇盛花期完全開(kāi)放、花絲完全伸長(zhǎng)、空間分布均一的單花。用鑷子從花絲基部將花絲取下并去除花藥，立即用游標(biāo)卡尺測(cè)量各個(gè)花絲長(zhǎng)度。

1.2高葶韭花粉育性的測(cè)定 花粉育性一般用花粉活力和花粉萌發(fā)率衡量[11]。本研究采用5種不同的花粉活力的染色檢驗(yàn)方法,即0.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)、四甲基偶氮唑(MTT)、聯(lián)苯胺、醋酸洋紅、碘-碘化鉀以及離體萌發(fā)法[12-15]。

在田間采集完全伸出花被片還未散粉的、飽滿的、健康的花藥。將尚未散粉的花藥置于PC管中，自然條件下陰干，待自然散粉后立即測(cè)定花粉活力。取新鮮花粉置于載玻片上，分別滴入溶液，用解剖針將其混合均勻后，蓋上蓋玻片置于25 ℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在顯微鏡下觀察著色情況。0.5% TTC溶液染色時(shí)培養(yǎng)20～30 min，聯(lián)苯胺染色時(shí)靜置3～4 min，碘-碘化鉀染色時(shí)培養(yǎng)20～30 min，醋酸洋紅和MTT染色時(shí)靜置1～2 min。以經(jīng)過(guò)高溫殺死后的無(wú)活力花粉的著色能力為對(duì)照[14]，比較后判斷花粉活力的有無(wú)并確定具有活力花粉的顏色以及顏色變化規(guī)律。每個(gè)處理重復(fù)3次，每張片觀察時(shí)隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，每視野不少于30?；ǚ?。用花粉的著色率表示花粉的活力，計(jì)算花粉活力百分率。

離體萌發(fā)法以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的硼酸配以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蔗糖(分別為 0、5%、10%、15%、20%、25%、30%)。將新鮮的花粉置于載玻片上，先用膠頭滴管將上述培養(yǎng)基滴到載玻片上，培養(yǎng)基凝固后，新鮮花粉均勻地涂抹到培養(yǎng)基上，把載玻片置于底蓋內(nèi)放一張濾紙加入少許蒸餾水的培養(yǎng)皿上，于25 ℃ 的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)數(shù)。觀察花粉萌發(fā)情況，以花粉管伸長(zhǎng)長(zhǎng)度超過(guò)或等于花粉粒直徑作為已發(fā)芽(萌發(fā))的標(biāo)準(zhǔn)，由此確定高葶韭花粉適宜的培養(yǎng)基后，再測(cè)定花粉散粉后的育性變化特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1高葶韭雄蕊的形態(tài)特征與開(kāi)花動(dòng)態(tài) 高葶韭為頂生的傘形花序，兩性花，花期為5月中下旬。單花較小，具6枚綠色花被片，中脈較花被片顏色深，為深綠色；具6枚等長(zhǎng)的雄蕊，雄蕊數(shù)量固定。有3個(gè)內(nèi)輪花絲和3個(gè)外輪花絲，內(nèi)外輪花絲基部合生并與花被片基部貼生0.1～0.2 cm。高葶韭平均花絲長(zhǎng)度為0.87～1.02 cm(平均為0.94 cm)。船形的6枚花藥分別以丁字形著生于白色的花絲上，花藥呈縱縫狀開(kāi)裂，未散粉前呈黃色，散粉時(shí)呈淡黃色，散粉后呈深黃色。

高葶韭單花花被片展開(kāi)到閉合，單花經(jīng)過(guò)5個(gè)形態(tài)變化時(shí)期，即①花被片未展開(kāi)，小花朵呈燈籠狀；②花藥開(kāi)始伸出，花被片先端略展開(kāi)，小花朵呈杯狀；③花藥完全伸出，花被片完全展開(kāi)，小花朵呈碗狀；④花被片開(kāi)始閉合，小花朵略張口呈杯狀；⑤花被片完全閉合，小花朵呈燈籠狀。高葶韭單花花被片未開(kāi)裂小花朵呈燈籠狀時(shí)，6枚花藥合抱在柱頭上；高葶韭單花花被片一般在08:30-09:30(17～19 ℃，空氣相對(duì)濕度30%～50%)展開(kāi)，花被片先端略張口小花朵呈杯狀時(shí)，花藥開(kāi)始伸出；花被片完全展開(kāi)一般在09:30-11:30(20～22 ℃，空氣相對(duì)濕度40%～50%)，花朵呈碗狀時(shí)花藥全部伸出花被片，這個(gè)過(guò)程中內(nèi)輪的花絲花藥依次伸出花被片，當(dāng)內(nèi)輪第2枚花藥伸出時(shí)，外輪的第1枚花藥伸出，內(nèi)輪第3枚花藥伸出之后，外輪剩余2枚花藥幾乎同時(shí)伸出，從第1枚花藥開(kāi)始散粉到第6枚花藥全部散完粉一般需要10～12 h，最快的3～7 h，最長(zhǎng)的12～24 h；單花開(kāi)放至萎蔫全部過(guò)程歷經(jīng)4～5 d(圖 1)。

花藥散粉集中在11:30-19:30(22～30 ℃，空氣相對(duì)濕度25%～40%)，單枚花藥從散粉到完全散粉一般需要1.5～2 h，長(zhǎng)可達(dá)2～5 h，散粉結(jié)束后的花藥外壁呈桔色，花絲失水萎蔫。從第1枚花藥伸出花被片到花藥全部脫落一般需要4～5 d，此時(shí)，花被片完全閉合貼附在子房上。

高葶韭單花開(kāi)放時(shí)內(nèi)輪花被片先展開(kāi)，內(nèi)輪花絲最先開(kāi)始伸長(zhǎng)，內(nèi)輪花藥先伸出花被片，隨后外輪花被片展開(kāi)，外輪花藥陸續(xù)伸出花被片后柱頭開(kāi)始伸長(zhǎng)。

圖1 高葶韭雄花開(kāi)花動(dòng)態(tài)

開(kāi)花受環(huán)境的影響，晴天花被片展開(kāi)較快，花絲伸長(zhǎng)和柱頭伸長(zhǎng)較長(zhǎng)，花藥散粉較快，整個(gè)開(kāi)花過(guò)程也將縮短。陰天或雨天花被片展開(kāi)較慢，花絲伸長(zhǎng)不明顯，花藥散粉少或散粉很慢，若連續(xù)幾天溫度較低，整個(gè)開(kāi)花過(guò)程將會(huì)延長(zhǎng)1～2 d。

2.2高葶韭的花粉育性

2.2.1高葶韭花粉的活力 經(jīng)TTC法染色，有活力花粉為淡粉紅色、粉紅色至紅色?；诨ǚ刍盍︻伾蓽\至深的變化，有活力的花粉可以分為弱、中、強(qiáng)3個(gè)級(jí)別，與對(duì)照相比沒(méi)有活力或不育花粉為淡黃色。方差分析(表1)表明,2～6 h的著色率在88.9%～100%，無(wú)顯著差異，此階段表現(xiàn)出強(qiáng)的花粉活力；2～8 h的花粉萌發(fā)率大于50%。散粉6 h以后，花粉染色數(shù)量呈下降趨勢(shì)，散粉24 h后的花粉著色率為24.1%，且都染為淡粉紅色，花粉活力弱；48 h以后花粉著色率為1.4%。其余全部呈淡黃色，花粉已無(wú)活力。

經(jīng)MTT染色，有活力的花粉呈粉紅色、淡紫色至深紫色?；诨ǚ刍盍︻伾蓽\至深的變化，有活力的花粉可以分為弱、中、強(qiáng)3個(gè)級(jí)別，與對(duì)照相比沒(méi)有活力或不育花粉呈淡黃色。方差分析(表1)表明,4～6 h的著色率在92.3%～93.7%，無(wú)顯著差異，此階段表現(xiàn)出強(qiáng)的花粉活力；0～10 h的花粉萌發(fā)率大于50%。散粉8 h以后，花粉染色數(shù)量呈下降趨勢(shì)，散粉24～72 h的著色率無(wú)極顯著差異，24 h后的花粉著色率為14.7%，48 h以后花粉著色率為1.5%，且都染為粉紅色，表現(xiàn)出花粉活力弱。其余全部呈現(xiàn)淡黃色，花粉已無(wú)活力。

表1 高葶韭花粉活力與花粉萌發(fā)率

經(jīng)聯(lián)苯胺染色，有活力的花粉呈淡粉紅色、粉紅色至紅色。基于花粉活力顏色由淺至深的變化，有活力的花粉可以分為弱、中、強(qiáng)3個(gè)級(jí)別，與對(duì)照相比沒(méi)有活力或不育花粉呈淡黃色。方差分析(表1)表明，散粉后4～6 h的著色率在80.6%～86.6%，無(wú)顯著差異，此階段表現(xiàn)出強(qiáng)的花粉活力；2～10 h的花粉萌發(fā)率大于50%。散粉8 h以后，花粉染色數(shù)量呈下降趨勢(shì)，且大部分花粉都呈現(xiàn)粉紅色或淡粉色；散粉36～72 h的著色率無(wú)極顯著差異；36 h后的花粉著色率為10.1%，且都染為淡粉紅色，表現(xiàn)出花粉活力弱；48 h以后花粉著色率為2.1%，其余全部呈現(xiàn)淡黃色，花粉已無(wú)活力。

花藥散粉后無(wú)論何時(shí)取樣檢測(cè)，經(jīng)醋酸洋紅染色，有活力花粉和對(duì)照處理過(guò)的無(wú)活力或不育花粉染色率均被染成紫紅色，各處理間無(wú)顯著或極顯著差異，沒(méi)有獲得可以鑒定花粉活性的指標(biāo)，因而無(wú)法區(qū)分和判斷花粉活力。

花藥散粉后無(wú)論何時(shí)取樣檢測(cè)，經(jīng)碘-碘化鉀染色，有活力花粉和對(duì)照處理過(guò)的無(wú)活力或不育花粉在染色過(guò)程中，花粉在極短的時(shí)間內(nèi)由黃色變成金黃色或黃褐色，著色和變色的速度都非?？?，肉眼無(wú)法觀察區(qū)分，花粉最終均被染成金黃色或黃褐色，各處理間無(wú)顯著或極顯著差異，沒(méi)有獲得可以鑒定花粉活性的指標(biāo)，因而無(wú)法區(qū)分和判斷花粉活力。

2.2.2高葶韭花粉的萌發(fā) 試驗(yàn)結(jié)果表明，離體萌發(fā)法測(cè)定高葶韭花粉生長(zhǎng)能力的適宜蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，不添加或添加過(guò)多蔗糖都顯著或極顯著影響花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)。在此試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上采用10%蔗糖配比的培養(yǎng)基進(jìn)行花粉生長(zhǎng)能力分析，方差分析(表1)表明，散粉后6 h花粉萌發(fā)率最高，表現(xiàn)出強(qiáng)的花粉活力，與其他時(shí)間的花粉萌發(fā)率存在極顯著差異。 2～10 h的花粉萌發(fā)率大于50%。散粉6 h以后，花粉萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)，48 h以后花粉萌發(fā)率為0，花粉已無(wú)活力。

通過(guò)5種染色檢驗(yàn)方法以及1種萌發(fā)法測(cè)定高葶韭花粉育性表明，TTC、MTT、聯(lián)苯胺和離體萌發(fā)可以用來(lái)檢驗(yàn)高葶韭花粉活力和花粉萌發(fā)率(圖2、圖3)，而醋酸洋紅和碘-碘化鉀這2種方法不能真實(shí)反映高葶韭花粉活力的變化，因此不適合高葶韭花粉育性的測(cè)定。不同檢測(cè)手段試驗(yàn)結(jié)果表明，高葶韭花粉是可育的，其花粉育性的變化規(guī)律也是一致的，高葶韭花粉活力最強(qiáng)的時(shí)期在2～8 h，花粉活力(萌發(fā)率)超過(guò) 50%(圖3)。

3 討論與結(jié)論

雄蕊開(kāi)花進(jìn)程中的形態(tài)特征變化表明，高葶韭具有雌雄異熟、雄蕊先熟于雌蕊的花部特征，直接影響著開(kāi)花、授粉等有性繁殖過(guò)程，從而影響種子形成。其6枚花藥分別伸出分別散粉，花藥和花粉逐次逐級(jí)呈現(xiàn)相對(duì)延長(zhǎng)了散粉的總時(shí)間，最大程度讓花粉資源有效利用，保障傳粉的成功，是對(duì)新疆干旱半干旱地理氣候條件的長(zhǎng)期適應(yīng)的結(jié)果，與新疆其他野生蔥屬植物的開(kāi)花動(dòng)態(tài)也具有類似特點(diǎn)[16-17]。與新疆荒漠植物的繁殖特點(diǎn)具有一定的一致性[18]。開(kāi)花特點(diǎn)表明高葶韭為日開(kāi)型花，4～5 d花期屬于短壽命花。

圖2 高葶韭花粉育性測(cè)定

圖3 高葶韭花粉活力與花粉萌發(fā)率

高葶韭花藥散粉后，花粉高于50%的活力或萌發(fā)率只能維持2～10 h，48 h后無(wú)活力或萌發(fā)率，屬于短壽命花粉。這與經(jīng)氯化三苯基四氮唑染色法檢測(cè)3種野生蔥屬植物蒙古韭、堿韭和細(xì)葉韭花粉活力的結(jié)果一致，花粉活力均在開(kāi)花初期較高，花粉壽命均約8 h[19]。生產(chǎn)實(shí)踐中，為了解決親本花期不一致或遠(yuǎn)距離雜交的困難，需要保存花粉的活力，因此花粉生活力測(cè)定是進(jìn)行人工輔助授粉或雜交授粉的基礎(chǔ)，同樣，也是高葶韭野生植物資源保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)利用的前提。

在許多植物資源花粉育性檢驗(yàn)中都存在適宜的檢測(cè)手段[20-21]，韭菜花粉活力檢測(cè)的最佳方法是離體萌發(fā)法，而碘-碘化鉀法、TTC法和無(wú)機(jī)酸法不適合韭菜花粉生活力的檢測(cè)[22]，由于單一染料只反映花粉細(xì)胞胞質(zhì)發(fā)育的一個(gè)指標(biāo)，因而本試驗(yàn)采用多種染色方法更客觀地判斷花粉的活性，TTC染色法、MTT法、聯(lián)苯胺法、離體萌發(fā)法適用于測(cè)定高葶韭花粉育性，且可以通過(guò)顏色變化將花粉活力分級(jí)，而醋酸洋紅法、碘-碘化鉀法不適用于測(cè)定高葶韭花粉育性，可為野外操作提供更加實(shí)用、便捷、可靠的方法，需要強(qiáng)調(diào)的是花粉活力測(cè)定研究中一定要將人工殺死的花粉設(shè)置成無(wú)活力花粉作為對(duì)照，比較它們之間的花粉著色能力有助于提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

花粉活力測(cè)定方法表現(xiàn)出的選擇性是與花粉體內(nèi)各種酶活性和物質(zhì)含量與組成相關(guān)，為進(jìn)一步開(kāi)展小孢子培養(yǎng)、花粉發(fā)育與花藥內(nèi)源激素變化、花粉生理結(jié)構(gòu)與代謝特點(diǎn)、花粉生態(tài)適應(yīng)性、外源物質(zhì)對(duì)花粉育性調(diào)控、花粉育性與結(jié)實(shí)關(guān)系等方面研究提供有價(jià)值的參考。

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