(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510300)

卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)屬鱸形目(Perciformes),鲹科(Carangidate),鯧鲹亞科(Trachinotinae),鯧鲹屬(Trachinotus),俗名黃臘鯧、金鯧、卵鲹、紅三、紅沙等,是一種暖水性魚類,廣泛分布于世界各大洋,在東南亞、澳大利亞、日本、美洲熱帶和溫帶的大西洋海岸等地均有分布[1]。在中國的東海、南海和黃海,特別是廣東、廣西、海南和福建沿海均有一定的資源量。近年來海南省近海網(wǎng)箱養(yǎng)殖的卵形鯧鲹出現(xiàn)大批死亡,本研究小組已經(jīng)對病原進行分離、鑒定,結(jié)果證實其病原菌為美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種(Photobacterium damselaesubsp.piscicida)[2]。由美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種引起的疾病稱為發(fā)光桿菌病,該菌能引起多種海水魚類發(fā)病,以前稱巴斯德桿菌癥(Pasteurelosis)或假性結(jié)核病(Pseudotuberculosis),病原為殺魚巴斯德桿菌(Pastrurella piscicida),1995年更名為美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種,本病是以脾臟、腎臟及肝臟等器官的表面及實質(zhì)出現(xiàn)大量灰白色壞死結(jié)節(jié)為主要臨床特征,發(fā)病率約為 60%,致死率約為 50%,潛伏期大約一周左右[3]。本研究采取腹腔注射和浸泡兩種方式感染卵形鯧鲹,對其進行系統(tǒng)的病理學(xué)觀察。目前尚未見美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種感染卵形鯧鲹病理學(xué)方面的報道,該研究將為闡明致病機理及診斷提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚與菌株

卵形鯧鲹購自海南省陵水新村某養(yǎng)殖場,體質(zhì)量約50 g,外觀無傷,游動活潑、攝食正常。實驗在南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)開發(fā)中心陵水實驗站進行,卵形鯧鲹暫養(yǎng)在9個1 m3水體的玻璃鋼桶中,置于通風(fēng)的室內(nèi),溫度在 27℃±1.5℃,水源為經(jīng)沙慮處理的天然海水,小型充氣機全天充氣。人工感染所用的美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種 TOS1菌株由本研究小組分離自發(fā)病卵形鯧鲹的腎臟和脾臟[2]。

1.2 實驗分組及人工感染

取90尾健康的卵形鯧鲹,平均分成 3組,分別為腹腔注射、浸泡和對照組,每組30尾,每組3個平行,每個平行組 10尾魚放養(yǎng)于一個玻璃鋼桶中,每天早晚投喂商品飼料各1次,換水和清洗桶底1次,暫養(yǎng) 7 d后進行人工感染。TOS1菌株在培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng) 24 h后,用滅菌的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.2,0.01 mol/L)配制成 1.0×109cfu/mL用于腹腔注射,每尾注射0.1 mL。浸泡組處理方式為,在桶中加入少量海水,用培養(yǎng)的菌液配制成 1.0×107cfu/mL,將魚放入浸泡1 h。對照組是用PBS(0.01 mol/L)每尾腹腔注射0.1 mL。實驗過程中觀察各組的臨床癥狀,并記錄累積死亡率。

1.3 組織病理切片的制備及觀察

取典型發(fā)病癥狀的病魚,解剖后分別取鰓、心、肝臟、腎臟、脾臟、腸等器官的小塊組織,置于10%的中性福爾馬林固定液中固定24 h以上,經(jīng)酒精逐級脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋,進行切片,厚度為 5 μm,然后經(jīng)二甲苯脫蠟,酒精逐級復(fù)水,用蘇木精-伊紅(H.E)染色,再經(jīng)酒精逐級脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,最后用Leica DM顯微鏡觀察并拍照。

1.4 超薄切片的制備及電鏡觀察

取典型發(fā)病癥狀的病魚,解剖后取腎臟、脾臟和肝臟等組織,切成 1 mm3大小的小塊,置于 2.5%戊二醛固定液中固定,經(jīng)乙醇脫水,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,醋酸鈾及檸檬酸鉛染色,用透射電鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 人工感染的累積死亡率及臨床癥狀

各處理組的卵形鯧鲹在感染第21天后不再發(fā)生新的死亡病例,因此在感染后28 d則停止臨床觀察,各組累積死亡率見圖1。結(jié)果顯示,腹腔注射后的3～7 d是死亡的高峰期,累積死亡率高達(dá)63.3%,到第21天累積死亡率僅上升至73.3%。浸泡組的累積死亡率較低,到第21天累積死亡率才達(dá)到30%。通過腹腔注射和浸泡致病的卵形鯧鲹在臨床癥狀上可分為急性和慢性,通過觀察,發(fā)現(xiàn)腹腔注射途徑的以急性型病例為主,而浸泡感染的主要以慢性型癥狀。感染的卵形鯧鲹仍表現(xiàn)為游動速度快,活力和攝食好,當(dāng)發(fā)現(xiàn)魚活力下降,拒絕攝食,在桶底慢游時,卵形鯧鲹則會很快死亡。部分急性型癥狀的魚通常在感染7 d內(nèi)死亡,但魚體表癥狀不明顯,解剖瀕死的病魚通常發(fā)現(xiàn)鰓部輕微出血,腹腔有積液,在脾臟和腎臟會出現(xiàn)灶狀壞死(圖2-1,2-2)。而慢性型癥狀的魚通常在感染7 d后,僅少數(shù)的魚會死亡,魚活力下降,攝食量減少,解剖瀕死的病魚能觀察到腎臟和脾臟腫大呈暗紅色,在其表面和實質(zhì)布滿直徑0.5～1.0 mm 白色顆粒狀結(jié)節(jié),也可在心臟內(nèi)觀察到少量的白色壞死結(jié)節(jié)(圖2-3,2-4)。同時在急性和慢性癥狀卵形鯧鲹的腎臟和脾臟內(nèi)均分離到與感染菌株形態(tài)、生理生化及16S RNA分子鑒定完全一致的菌株。

圖1 美人魚發(fā)光桿菌TOS1感染卵形鯧鲹的累積死亡率Fig.1 Accumulative mortalities of Trachinotus ovatus infected with Photobacterium damselae TOS1 strain

圖2 美人魚發(fā)光桿菌感染卵形鯧鲹的臨床癥狀Fig.2 Clinical signs of Trachinotus ovatus infected with Photobacterium damselae

2.2 組織病理變化

2.2.1 鰓

急性型的卵形鯧鲹鰓絲排列不整齊,呈波狀扭曲,鰓絲組織的完整性受到破壞,次級鰓片水腫、變性,有蛋白樣物質(zhì)滲出,泌氯細(xì)胞增生(圖3-1)。慢性型的卵形鯧鲹,次級鰓絲完全融合,鰓絲上皮細(xì)胞脫落、壞死,鰓中央靜脈竇擴張、嚴(yán)重充血,鰓絲發(fā)生局灶狀壞死(圖3-2)。

2.2.2 心臟

急性型的卵形鯧鲹心肌纖維排列整齊,但心肌細(xì)胞會發(fā)生多灶性壞死,組織中有大量的細(xì)胞核碎片(圖3-3)。慢性型的卵形鯧鲹,心外膜增厚,肌間隙明顯增寬、水腫,心肌纖維變性橫紋模糊,斷裂,排列紊亂,心肌細(xì)胞發(fā)生肉芽腫病變(圖3-4)。

圖3 美人魚發(fā)光桿菌感染卵形鯧鲹的組織病理學(xué)變化Fig.3 Histopathological changes of Trachinotus ovatus infected with Photobacterium damselae

2.2.3 肝臟

急性型的卵形鯧鲹肝細(xì)胞腫大,肝索結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞發(fā)生顆粒變性,有的肝小葉的肝細(xì)胞大面積發(fā)生凝固性壞死(圖3-5)。慢性型的卵形鯧鲹,肝細(xì)胞變性,肝血竇擴張、充血及血管發(fā)生栓塞現(xiàn)象,肝細(xì)胞發(fā)生肉芽腫病變(圖3-6)。

2.2.4 腎臟

急性型的卵形鯧鲹腎臟實質(zhì)部的腎小管上皮細(xì)胞腫脹,有的腎小管上皮細(xì)胞脫落、壞死,與基底膜完全分離,形成一空腔,腎小球發(fā)生變性和壞死,大量的腎間質(zhì)組織黑色素巨噬細(xì)胞聚集,形成多個黑色素巨噬中心(圖3-7)。腎臟間質(zhì)的造血組織和淋巴組織出現(xiàn)大面積的壞死,壞死灶周圍有大量的炎癥細(xì)胞浸潤。慢性型的卵形鯧鲹,腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞,數(shù)量減少,腎間質(zhì)有大量的紅細(xì)胞滲出,嚴(yán)重出血,腎造血組織發(fā)生肉芽腫病變(圖3-8)。

2.2.5 脾臟

急性型的脾臟紅髓和白髓結(jié)構(gòu)模糊,網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增多,淋巴組織出現(xiàn)壞死,并伴有炎性細(xì)胞浸潤。慢性型的脾血髓竇擴張淤血、脾間質(zhì)出血,可見大量正在形成中的肉芽腫(圖3-9),脾臟內(nèi)成熟肉芽腫的結(jié)節(jié)中央為干酪樣壞死區(qū),H.E染色呈嗜酸性,由壞死的組織細(xì)胞、白細(xì)胞及細(xì)菌組成,壞死區(qū)被巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞包裹,最外層為成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞(圖3-10)。

2.2.6 腸

急性型的卵形鯧鲹,腸道的組織學(xué)變化不明顯。慢性型的卵形鯧鲹,腸黏膜上皮發(fā)生變性、脫落、黏膜固有層出血及局灶性壞死(圖3-11),在腸黏膜固有層可觀察到肉芽腫病變(圖3-12)。

2.3 超微病理變化

2.3.1 脾

急性型的卵形鯧鲹脾淋巴細(xì)胞發(fā)生灶狀壞死,細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)環(huán)狀,位于核周邊,即染色質(zhì)邊集,病灶處巨噬細(xì)胞增多,準(zhǔn)備吞噬異物(圖4-1)。

慢性型的卵形鯧鲹脾臟內(nèi)多處發(fā)生肉芽腫病變,在肉芽腫的中心僅見少量淋巴細(xì)胞核染色質(zhì)聚集成大小的團塊,溶酶體增多,細(xì)菌溶解,很難見到完整的細(xì)菌形態(tài),線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)完全溶解(圖4-2)。

2.3.2 腎

急性型的卵形鯧鲹腎小管上皮細(xì)胞的發(fā)生空泡變性,微絨毛排列紊亂,腎小球基膜加厚,遭到破壞,腎造血組織細(xì)胞核基質(zhì)減少,其他細(xì)胞器數(shù)量減少,線粒體腫脹,嵴斷裂(圖4-3)。慢性型的卵形鯧鲹腎臟多處發(fā)生肉芽腫病變,腎小管上皮細(xì)胞的微絨毛脫落,細(xì)胞高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解,僅見增多溶酶體和大量的細(xì)胞器碎片(圖4-4)。

圖4 美人魚發(fā)光桿菌感染卵形鯧鲹的超微病理學(xué)變化Fig.4 Ultrastructural pathologicalchanges of Trachinotus ovatus infected with Photobacterium damselae

2.3.3 心

急性型的卵形鯧鲹心肌細(xì)胞線粒體增生,部分線粒體腫脹,細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體極少(圖4-5)。慢性型的卵形鯧鲹心肌原纖維Z帶排列紊亂,斷裂,線粒體變性,嵴減少,可見到較大的泡狀脂滴(圖4-6)。

3 討論

卵形鯧鲹是一種抗病力較強的海水魚類,以前關(guān)于其病害方面的報道極少。但由于養(yǎng)殖密度的提高及近海環(huán)境污染的加重,現(xiàn)卵形鯧鲹病害方面的報道也開始增多,大多為細(xì)菌病,病原主要有嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia)、魚諾卡氏菌(Nocardia seriolae)和創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)等[4-7],而由病毒引起僅見神經(jīng)壞死癥[8],寄生蟲病主要由刺激隱核蟲(Cryptocaryon irritans)引起,且致死率非常高[9]。近幾年在中國南方沿海調(diào)查發(fā)現(xiàn),美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種的感染能導(dǎo)致卵形鯧鲹大批的死亡[2]。海水魚的發(fā)光桿菌病對養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失,1968年,在美國切薩皮克灣的野生白鱸(Morone americanus)與條紋鱸(Morone saxatilis)首次發(fā)現(xiàn)發(fā)光桿菌病[10],1970年此病造成了德克薩斯州的大西洋油鯡(Brevoortia tyrannus)與條紋鱸的大量死亡[11],這種病原菌在日本造成養(yǎng)殖魚(Seriola quinqueradiata)的大量死亡,在法國、意大利及西班牙等國也造成養(yǎng)殖魚類嚴(yán)重的損失,使許多海水魚養(yǎng)殖場倒閉[12]。中國臺灣地區(qū)首先在淡水養(yǎng)殖的斑鱧(Ophiocephalus maculates)發(fā)現(xiàn)發(fā)光桿菌病,之后,在夏季水溫偏高的時期,養(yǎng)殖的軍曹魚(Rachycentron canadum)也易發(fā)生此病[13-14],所以中國南方新發(fā)現(xiàn)的卵形鯧鲹發(fā)光桿菌病應(yīng)當(dāng)給予重視。

了解卵形鯧鲹發(fā)光桿菌病,首先要弄清其病理學(xué)的特征。本研究通過腹腔注射和浸泡兩種方式均可成功感染卵形鯧鲹,大多器官都遭受不同程度的損傷,推測病原菌及其毒素可能進入血液循環(huán)內(nèi),而引起卵形鯧鲹全身的病變。腹腔注射感染的呈現(xiàn)急性型死亡病例較多,可能腹腔注射途徑能使病原菌較快進入血液,在短時間內(nèi)對魚體造成較大的傷害。而浸泡感染途徑中病原菌需穿越更多的免疫防線才能進入到魚體的血液循環(huán),對魚體則是緩慢損傷過程,所以致死率不高,慢性型病例較多。人工感染美人魚發(fā)光桿菌的卵形鯧鲹體表病變不明顯,急性型卵形鯧鲹的鰓蓋處輕微出血,腹腔有積液,而慢性型卵形鯧鲹的脾臟、腎臟和肝臟表面和實質(zhì)布滿直徑0.5～1.0 mm的白色顆粒狀結(jié)節(jié)。慢性感染的卵形鯧鲹與自然發(fā)病魚臨床癥狀十分接近[2],與以前報道患發(fā)光桿菌病的金頭(Sparus aurata)、金槍魚(Thunnus thynnus)等癥狀也類似[15-16]。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),急性癥狀的卵形鯧鲹一些器官或組織遭受不同程度的損傷,主要是鰓、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、及腸道等器官出現(xiàn)淤血、出血、變性及壞死。而在慢性癥狀中,發(fā)現(xiàn)很多器官或組織有典型的肉芽腫病變,肉芽腫結(jié)構(gòu)可分3層,肉芽腫中央為干酪樣壞死區(qū),主要為壞死的組織細(xì)胞、白細(xì)胞和細(xì)菌等;在壞死區(qū)周圍有大量胞體較大、邊界不清的細(xì)胞,主要為類上皮細(xì)胞和多核巨細(xì)胞,有時可見大量炎性細(xì)胞浸潤類上皮細(xì)胞周圍;最外層由數(shù)層成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞組成的包膜包圍。在魚類疾病中能引起肉芽腫病變的病原大多是革蘭氏陽性菌,常見的有分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)及諾卡氏菌(Nocardiasp.)等[17-18],而由革蘭氏陰性菌引起報道的較少,如愛德華氏菌(Edwardsiella tarda) 和美人魚發(fā)光桿菌等[14,19]?；及l(fā)光桿菌病的卵形鯧鲹內(nèi)臟器官雖然有典型的肉芽腫病變特征,但發(fā)病魚的體表病變則不明顯。

通過對各器官進行比較,脾臟、腎臟和心臟病變最為嚴(yán)重。脾組織損壞會導(dǎo)致機體營養(yǎng)不良,免疫力下降,對外來病原侵襲的抵抗力會減弱[20]。腎組織發(fā)生的上述病變,使得魚體內(nèi)、外滲透壓平衡失調(diào),而且會使魚機體貧血,免疫力下降[21]。心肌細(xì)胞的病變可能引起全身血液循環(huán)障礙、缺氧等一系列功能障礙[22],上述卵形鯧鲹三大重要器官發(fā)生的病理損傷,是加速或?qū)е卖~死亡的原因之一。對其進一步的電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)在急性病例的脾臟中,是以巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞增多,在腎臟中,腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生變性,微絨毛也發(fā)生病變,心臟的中線粒體增生、腫脹。在慢性病例中,各病灶部位的細(xì)胞大多發(fā)生不可逆的病理變化,亞細(xì)胞器發(fā)生溶解,發(fā)現(xiàn)大量的組織碎片,可見慢性型發(fā)光桿菌的卵形鯧鲹病灶是難以康復(fù)的。從組織病理學(xué)變化特征來看,國外報道的其他海水魚類發(fā)光桿菌病形成肉芽腫病變的器官主要是脾臟、腎臟和肝臟[23-25],而本研究發(fā)現(xiàn),除上述 3個器官外,卵形鯧鲹心臟和腸道內(nèi)也發(fā)生典型的肉芽腫病變,說明美人魚發(fā)光桿菌在卵形鯧鲹內(nèi)所損傷的靶器官更多,這些組織器官同卵形鯧鲹的生命活動息息相關(guān),組織器官生理功能的喪失,最終導(dǎo)致卵形鯧鲹死亡。作者為進一步研究卵形鯧鲹發(fā)光桿菌病的致病機理奠定基礎(chǔ)。

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