馮雅靜， 李永渝， 林旭紅， 李 琨， 余良英， 曹明華， 徐 菁

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，同濟(jì)大學(xué)消化系統(tǒng)疾病研究所，上海200092)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組慢性腸道炎癥性疾病，主要包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)［1］。盡管臨床上對IBD的研究和治療已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，但由于其發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，治療藥物療效有限并且產(chǎn)生副作用較大，因此，探究IBD的新型治療靶點(diǎn)和新型治療藥物仍然是相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

大麻類物質(zhì)對腸道炎癥的治療已有很多報(bào)道［2］，但由于它們具有引發(fā)精神迷幻、成癮等副作用，在臨床上的應(yīng)用受到了限制。O－1602是最近人工合成的大麻類制劑，它和大麻二酚(cannabidiol，CBD)分別是新型大麻素受體G蛋白偶聯(lián)受體55(G protein－coupled receptor 55，GPR55)的激動(dòng)劑和反向激動(dòng)劑，其作用專一、副作用小，在治療腸道炎癥中可能具有良好的應(yīng)用前景［3－4］，但它們在潰瘍性結(jié)腸炎中的作用少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究O－1602及CBD對硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的抗炎作用，并從以下2個(gè)方面探討O－1602和CBD可能的作用機(jī)制:(1) p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen－activated protein kinase，MAPK)在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和促炎細(xì)胞因子生成中起著重要的作用［5］，O－1602和CBD是否通過p38 MAPK信號通路發(fā)揮作用?(2)檢測GPR55在小鼠腸道的表達(dá)分布以及在結(jié)腸炎時(shí)的變化，明確GPR55及其配體在其中的可能作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 6～8周齡，體重18～24 g C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 DSS，分子量36 000～50 000，購自MPBIO;O－1602和SB203580購自Tocris;CBD購自Biotrend;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF－α)、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL－6)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞化學(xué)趨化因子1(cytokineinduced neutrophil chemoattractant，CINC－1)ELISA試劑盒均購自R＆D;髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所; GPR55多克隆抗體購自Enzo;p38多克隆抗體和pp38多克隆抗體購自Santa Cruz;免疫組化Ⅱ抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;β－actin和Western blotting抗兔Ⅱ抗購自Abmart;BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 主要儀器 PRO精密勻漿器(Pro Scientific); ELX800酶標(biāo)儀 (BioTek);Leica DM2500顯微鏡(Leica);PowerPac Basic電泳儀(Bio－Rad);Mini－PROTEAN 3小型垂直電泳槽、濕轉(zhuǎn)儀(Bio－Rad); ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀(Fuji)。

2 方法

2.1 DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，雌雄各半。(1)對照組:正常飲用自來水，腹腔注射藥物溶劑:3%DMSO+2%Tween 80+生理鹽水(saline water)，每天注射1次，持續(xù)7d。(2)結(jié)腸炎組:飲用含4%DSS的水，腹腔注射藥物溶劑，每天注射1次，持續(xù)7 d。(3)O－1602組:飲用4% DSS水，腹腔注射O－1602(5 mg/kg)，每天注射1次，持續(xù)7 d。(4)CBD組:飲用4%DSS水，腹腔注射CBD(1 mg/kg)，每天注射1次，持續(xù)7 d。(5) SB203580組:飲用4%DSS水，腹腔注射SB203580(5 μmol/kg)，DSS進(jìn)行造模后60 h開始注射，每日注射2次，直至造模結(jié)束［6］。結(jié)腸炎造模方法及 O－1602、CBD的藥物濃度參照了參考文獻(xiàn)［7－9］和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 取材 C57BL/6小鼠進(jìn)行結(jié)腸炎造模的第7 d，在異氟烷麻醉下斷頭處死，斷頭后迅速經(jīng)頸動(dòng)脈取血放入經(jīng)肝素化處理的Eppendorf管中，并仔細(xì)切取結(jié)腸組織標(biāo)本和肺組織標(biāo)本。血液標(biāo)本在12 000 ×g、4℃離心10 min，留取上清液之后存儲在－80℃待檢。結(jié)腸組織標(biāo)本稱重、測量標(biāo)本長度之后，將其縱向切開，觀察糞便狀況后清理掉糞便并用生理鹽水進(jìn)行沖洗。將結(jié)腸組織標(biāo)本分為幾段，其中一段迅速放入10%中性甲醛中;其余部分連同肺組織標(biāo)本一起迅速放入液氮中冷凍，之后存儲在－80℃待檢。

2.3 小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎評分系統(tǒng) 結(jié)腸炎評分系統(tǒng)主要用來描述代表了結(jié)腸炎癥程度的各種參數(shù)指標(biāo)，包括大體評分(macroscopical score，MS)和組織病理評分(histopathological score，HS)2部分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1、2。本研究評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)報(bào)道［6］并進(jìn)行了合理的改進(jìn)。MS最大分值為12分，評分參數(shù)主要包括了糞便、結(jié)腸重量和結(jié)腸長度。HS最大分值為11分，評分參數(shù)主要包括黏膜完整性、腺窩損害、充血水腫和炎癥細(xì)胞浸潤。MS評分在結(jié)腸組織取材過程中完成，將結(jié)腸組織制作成切片后進(jìn)行HE染色，HS評分主要在顯微鏡觀察下完成。

表1 大體評分表Table 1 .Macroscopical score

表2 組織病理評分表Table 2 .Histopathological score

2.4 ELISA法定量分析血漿細(xì)胞因子和趨化因子水平 使用ELISA檢測試劑盒對血漿中細(xì)胞因子TNF－α、IL－6和CINC－1進(jìn)行檢測。血漿標(biāo)本獲取方法如前面所述，ELISA檢測方法按照操作指南進(jìn)行，所有的血漿標(biāo)本都分為2份進(jìn)行檢測，結(jié)果以ng/L或者相對對照組的百分比形式表示。

2.5 肺組織MPO活性檢測 取150～200 mg肺組織在均漿器中均漿，之后在蛋白裂解液作用下冰上裂解1 h。隨后標(biāo)本在10 000×g，4℃離心15 min，留取上清液，部分上清液使用BCATM蛋白定量方法對其進(jìn)行蛋白定量，部分上清液使用MPO檢測試劑盒檢測其MPO活性。MPO活性檢測方法按照操作指南進(jìn)行，結(jié)果以U/g肺組織(濕重)表示，并計(jì)算出各組MPO活性相對于對照組的百分比。

2.6 免疫組化方法檢測結(jié)腸GPR55的表達(dá) 取結(jié)腸近段3～4 cm處結(jié)腸組織，經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，切片(5 μm)，最后鑲嵌在載玻片上。免疫組化實(shí)驗(yàn)操作過程主要包括程序性地脫蠟、水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min，以及微波熱修復(fù)抗原。10%山羊血清孵育10 min之后，標(biāo)本在4℃下被GPR55Ⅰ抗(濃度1∶20)孵育，過夜，之后標(biāo)本在37℃下被酶標(biāo)Ⅱ抗孵育30 min，使用免疫組化染色試劑盒對玻片標(biāo)本進(jìn)行染色以及蘇木素復(fù)染后，在Leica DM2500顯微鏡下獲取免疫組化圖片。

2.7 Western blotting方法檢測結(jié)腸組織p38及pp38蛋白表達(dá)水平 結(jié)腸組織加入蛋白裂解液，均漿，使之充分裂解后，離心取其上清液。使用BCATM蛋白定量方法對其蛋白濃度進(jìn)行測定，之后加入含十二烷基硫酸鈉(SDS)的上樣緩沖液，95～100℃變性10 min。按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［9］完成SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)和蛋白轉(zhuǎn)膜操作，上樣樣品量為25 μg蛋白。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗滌后PVDF膜在4℃ 下分別與各個(gè)Ⅰ抗(p38多克隆抗體，1∶350稀釋;p－p38多克隆抗體，1∶400稀釋)及內(nèi)參照(β－actin多克隆抗體，1∶2 000稀釋)孵育過夜。TBST洗膜，PVDF膜在室溫下與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀曝光、采集圖像，采用ImageJ 1.44p軟件對Western blotting結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1 O－1602及CBD改善DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的病理損害

小鼠飲用4%DSS 7 d后，結(jié)腸炎組表現(xiàn)為結(jié)腸重量減輕，長度縮短，便血等，見圖1;鏡下可見黏膜損害，腺窩結(jié)構(gòu)破壞，黏膜下充血、水腫以及炎細(xì)胞浸潤等改變，見圖2。O－1602及CBD處理組大體和鏡下病理變化明顯減輕，MS和HS評分與結(jié)腸炎組相比明顯下降(P＜0.05)，表明O－1602和CBD改善了小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的病理損害。在此實(shí)驗(yàn)中其作用和O－1602和CBD的藥物作用相比較，其MS和HS評分與結(jié)腸炎組相比有顯著下降(P＜0.05)。

Figure 1.Macroscopical scores of the colon in C57BL/6 mice with DSS－induced colitis.±s.n=8.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs colitis.圖1 DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎C57BL/6小鼠結(jié)腸的大體評分結(jié)果

Figure 2.Histopathological changes and scores(F)of the colon tissues in C57BL/6 mice with DSS－induced colitis(HE staining，× 100).A:control;B:colitis;C:O－1602;D:CBD;E:SB203580.Arrows indicate damage in epithelium，edema in the submucosa，as well as infiltration with inflammatory cells.±s.n=8.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs colitis.圖2 DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎C57BL/6小鼠結(jié)腸的組織病理評分結(jié)果

2 O－1602及CBD降低血漿炎癥介質(zhì)的水平以及肺組織MPO的活性

血漿中的細(xì)胞因子TNF－α、IL－6和CINC－1是反映結(jié)腸炎炎癥程度的衡量指標(biāo)。本結(jié)果看到，在結(jié)腸炎組，這些指標(biāo)明顯高于對照組(P＜0.05)，而O－1602和CBD處理組則較結(jié)腸炎組有顯著的下降(P＜0.05)，SB203580處理組同樣明顯低于結(jié)腸炎組(P＜0.05)，見圖3。

肺組織MPO活性既是反映嗜中性粒細(xì)胞浸潤的直接標(biāo)志又可間接反映全身性炎癥反應(yīng)時(shí)遠(yuǎn)隔器官受累的指標(biāo)。如圖3中所示，結(jié)腸炎組肺組織MPO活性顯著高于對照組(P＜0.05)，O－1602處理組、CBD處理組以及SB203580處理組中肺組織MPO活性較結(jié)腸炎組明顯降低(P＜0.05)。

Figure 3.The levels of inflammatory mediators in plasma and the MPO activity in lung tissues.±s.n=8.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs colitis.圖3 血漿炎癥介質(zhì)水平以及肺組織MPO活性

3 免疫組化方法檢測GPR55在小鼠結(jié)腸組織的表達(dá)及分布情況

GPR55在C57BL/6小鼠結(jié)腸組織中表達(dá)及分布如圖4中所示，箭頭所指的棕黃色染色細(xì)胞為陽性結(jié)果。本研究結(jié)果提示GPR55在整個(gè)結(jié)腸組織中表達(dá)量較少，主要分布在黏膜下層。與對照組相比，結(jié)腸炎組、O－1602處理組和CBD處理組GPR55表達(dá)變化不明顯，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 免疫印跡法檢測小鼠結(jié)腸組織p－p38和p38的蛋白表達(dá)

p38和p－p38蛋白表達(dá)情況如圖5所示，結(jié)腸炎組p－p38/p38比值較對照組明顯升高(P＜0.05)，而O－1602和CBD處理組較結(jié)腸炎組顯著降低(P＜0.05)。SB203580作為p38 MAPK通路的抑制劑，能夠抑制p38蛋白的磷酸化，其p－p38/p38比值較結(jié)腸炎組顯著降低(P＜0.05)。

討論

IBD在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。IBD病程較長，常反復(fù)發(fā)作，遷延不愈，因而治療起來比較困難。針對IBD的治療，臨床現(xiàn)階段主要以免疫抑制劑和抗炎藥物治療為主，例如糖皮質(zhì)激素、水楊酸鹽、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺或現(xiàn)代免疫調(diào)節(jié)劑如生物制劑TNF－α受體阻滯劑等等。然而，跟蹤調(diào)查顯示，這些藥物的治療效果并不令人滿意［5］。有的為了維持療效而長期用藥，常常引發(fā)各種副作用。

歷史上關(guān)于大麻的應(yīng)用已有千余年的歷史，早在一個(gè)世紀(jì)以前，天然植物大麻的提取物就在美國被廣泛用來治療各種原因引起的胃腸炎癥、腹痛、腹瀉、嘔吐等［10］，但是由于大麻素類物質(zhì)可以引發(fā)精神迷幻、成癮等副作用，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。研究表明，大麻素類物質(zhì)包括植物大麻提取出來的各種天然大麻制劑和人工合成大麻制劑以及機(jī)體代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性大麻類物質(zhì)［11］，它們主要通過體內(nèi)的大麻素受體(cannabinoid receptprs，CB)1型和2型，即CB1受體和CB2受體，以及新發(fā)現(xiàn)的GPR55等對機(jī)體多種功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［12］。近10年來，不少作用專一、副作用小的人工合成大麻制劑問世，O－1602就是其中一種，目前認(rèn)為它是GPR55的激動(dòng)劑。有研究揭示O－1602和其反向激動(dòng)劑CBD在神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、關(guān)節(jié)炎等炎癥反應(yīng)中具有抗炎作用［3－4］，對治療炎癥有良好的應(yīng)用前景。

Figure 4.Expression of GPR55 in mouse colon tissus(immunohistochemical staining，×400).A:control;B:colitis;C:O－1602; D:CBD.GPR55 expression in the immune cells were marked by the arrows and shown as positive results with brownyellow staining.圖4 GPR55在小鼠結(jié)腸組織的表達(dá)及分布情況

Figure 5.Expression of p－p38 and p38 in mouse colon tissues detected by Western blotting.±s.n=8.#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs colitis.圖5 小鼠結(jié)腸組織p－p38和p38蛋白的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)研究看到，O－1602和CBD均可減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎結(jié)腸組織病理損害，同時(shí)顯著降低血漿中TNF－α、IL－6和CINC－1等炎癥介質(zhì)水平，降低肺組織MPO活性，證明O－1602及CBD對DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有抗炎作用。

在結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)過程中，有多條信號通路參與了對炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其中p38 MAPK信號通路，發(fā)揮了非常重要的調(diào)控作用。p38 MAPK信號通路激活后，促使TNF－α、IL－1、IL－6等炎癥介質(zhì)的合成和分泌增加［5］;同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)－1、血管細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)－1、分形趨化因子(fractalkine，F(xiàn)KN)等趨化分子的表達(dá)上調(diào)［13］。本實(shí)驗(yàn)免疫印跡檢測結(jié)果顯示，小鼠經(jīng)DSS誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)腸炎后，結(jié)腸組織p38蛋白的磷酸化形式p－p38蛋白表達(dá)明顯增加，證實(shí)了p38 MAPK信號通路在結(jié)腸炎被激活。O－1602和CBD可抑制p38 MAPK信號通路，顯著降低p38蛋白的磷酸化程度，同時(shí)降低血漿TNF－α、IL－6等炎癥介質(zhì)的水平，這與抑制p38 MAPK信號通路的預(yù)期結(jié)果相一致，提示O－1602和CBD的抗炎作用與抑制p38 MAPK信號通路有關(guān)。

新型大麻素受體GPR55是一種G蛋白偶聯(lián)受體，也被稱為非CB1、非CB2受體的大麻受體。隨著與GPR55相關(guān)的新型大麻類制劑相繼被研發(fā)出來，GPR55的功能和作用受到越來越廣泛的關(guān)注。新型大麻制劑O－1602和CBD分別作為GPR55的激動(dòng)劑和反向激動(dòng)劑，在小鼠結(jié)腸炎中均表現(xiàn)出了抑制炎癥反應(yīng)的作用，兩者抗炎作用沒有顯著差異。它們發(fā)揮作用機(jī)制與GPR55之間的關(guān)系目前尚不明確，需要更多研究證實(shí)。CBD作為GPR55的反向激動(dòng)劑，其抗炎作用和激動(dòng)劑O－1602相似，可能的原因如下:內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endo－cannabinoid system，ECS)在調(diào)節(jié)腸道炎癥、胃腸運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮重要作用［12］，de Filippis等［14］發(fā)現(xiàn)CBD可以通過抑制脂肪酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH)來延緩內(nèi)源性大麻素的降解，導(dǎo)致內(nèi)源性大麻素水平增加，內(nèi)源性大麻素激活CB1、CB2受體后對腸道炎癥發(fā)揮抗炎作用。因此，CBD的抗炎作用很可能與CB受體激活有關(guān)而不是通過作用于GPR55。

本次實(shí)驗(yàn)研究初步探索了 GPR55受體在C57BL/6小鼠結(jié)腸的表達(dá)分布情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GPR55受體在結(jié)腸組織中表達(dá)量較少，主要分布在黏膜下層，結(jié)腸炎時(shí)GPR55受體表達(dá)變化不明顯。

綜上所述，新型大麻制劑O－1602和CBD能夠減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)，其發(fā)揮作用的機(jī)制可能與抑制p38 MAPK信號通路相關(guān)。此外，本研究首次探索了GPR55受體在C57BL/6小鼠結(jié)腸組織的表達(dá)分布情況，GPR55受體在結(jié)腸組織中表達(dá)量較少，主要分布在黏膜下層。

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