楊亮宇，孫永科，，楊玉艾，王 凱，王玉娥，孔令富＊

（1.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明650201；2.中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150001）

RNA干擾是指生物體在進化過程中，由高度保守的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘導同源mRNA高效特異性降解的現象。它是生物體抵御外來感染的一種重要保護機制。RNAi作為沉默特定基因功能的新技術，為基因功能的研究提供了一個高效、簡便的方法，在功能基因組學領域掀起一場革命。Science雜志在2001年將RNAi列為10大科學成就之一，2002年又將其列為當年10大科學成就之首，Nature雜志也將其評為2002年重大科技成果之一。2006年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獎授予兩名美國科學家安德魯-費里和克拉格-米洛，以表彰他們在RNA干擾現象發(fā)現過程中的貢獻。

1 RNAi的發(fā)現

目前，有效抑制基因表達的方法主要有基因敲除（knock out）、基因表達降低（knock down）、顯性陰性（dominant negative）、反義RNA（ant is en se RNA）等方法。這些方法均存在操作復雜，基因的選擇局限性大且結果不穩(wěn)定，無法預知試驗效果等局限性。因此科學家們試圖尋找更有效、易操作、結果更穩(wěn)定的技術方法。

1990年Orgenson等試圖將一個能產生色素的基因置于一個強啟動子后導入矮牽牛中，來增加花瓣的著色。然而卻出現了完全相反的結果，一些轉基因的花出現了全白或部分白色。這就提示，不僅導入的基因未被表達，反而連植物本身的某些合成色素的基因也失活，即出現了一種共抑制（cosuppression）現象［1］。1995年Guo和Kem Phues發(fā)現注射正義RNA和反義RNA均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲par-1基因的表達，該結果不能使用反義RNA技術的理論做出合理解釋。1998年，Fire等證實正義RNA抑制同源基因表達的現象是由于體外轉錄制備的RNA中污染了微量內源或外源雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）而引發(fā)并將這一現象命名為RNAi，這是生物界有關RNAi存在的首次報道［2］。

2 RNAi的作用機理

經過眾多學者的研究，現已基本闡明了RNAi的作用機理。一般認為dsRNA介導整個RNAi過程分為啟動、效應兩個主要階段。

2.1 啟動階段

外源性dsRNA進入細胞內，首先被一種叫Dicer的酶切割成大約22nt的小干擾RNA（siRNA）片斷。Dicer酶具有一個螺旋酶結構域，兩個RNaseⅢ結構域和一個雙鏈RNA結合位點，屬于RNaseⅢ超家族的一員，進化上非常保守，在rde-1（RNAi defective-1）或ago-1（argonaute-1）和rde-4介導下，能特異性的切割dsRNA，產生siRNA。在此過程中，有兩個需要ATP的步驟：①dsRNA的斷裂，需要ATP的參與使Dicer-dsRNA復合體具有活性。②ATP維持siRNA功能所必需的靶-負鏈siRNA的磷酸化。siRNA是RNAi作用的重要中介因子。典型的siRNA具有5′磷酸基、3′羥基和3′外懸2nt，長21nt～23nt的雙鏈RNA。21nt～23nt的siRNA至幾百個核苷酸的dsRNA都能誘發(fā)RNAi，但長雙鏈RNA阻斷基因的表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA。

2.2 效應階段

RNAi的效應階段就是siRNA降解同源mRNA的過程。siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC），每個RISC含一個siRNA和一個不同于Dicer酶的RNA酶。RISC依賴ATP將siRNA解雙鏈以激活RISC，激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄體上，并在距離siRNA 3′端12個堿基的位置切割mRNA，產生基因沉默效應。

3 RNAi的作用特點

RNAi比同源重組法更加簡便，周期大大縮短。對于哺乳動物，如對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細胞中利用RNAi技術研究它的功能。由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導通路的良好工具。RNAi還被用來研究在發(fā)育過程中起作用的基因如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中起著關鍵作用。除此以外，RNAi還具有結構的高度穩(wěn)定性、序列高度特異性、抑制作用的高效性、細胞間高傳遞性等，在某些生物中RNAi還可以傳遞到后代中去［3］。

4 RNAi在動物傳染病方面的研究

自首次報道以來，RNAi技術由于其優(yōu)越性而被迅速地應用于抗病毒及其相關方面的研究中。從當前的研究結果發(fā)現，RNAi針對不同基因序列都有效，而且特異性強、效率高、操作方便，可以利用特異性的siRNA技術針對病毒主要基因編碼區(qū)的保守序列或與病毒感染有關內源性基因，設計出特異性的針對靶序列的siRNA，這為預防治療病毒感染開辟了一條新途徑。下面簡要介紹RNAi近年來在豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、狂犬病、新城疫等重大動物傳染性疾病的研究進展。

4.1 RNAi技術在豬瘟方面的研究

豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的動物疫病。中國豬瘟兔化弱毒疫苗在防控豬瘟中曾起到決定性作用，但近幾年來免疫效果不理想。豬瘟病毒（CSFV）是黃病毒科瘟病毒屬的重要成員，為有囊膜病毒。CSFV基因組為單股正鏈RNA，全長約12kb，從5＇到3＇依次為5＇非翻澤區(qū)（5＇-NTR）、Npro、C、E0（Erns）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B和3＇非翻譯區(qū)（3＇-NTR），5＇端無帽子結構，3＇端無poly（A）尾巴。CSFV基因組編碼一條由結構蛋白和非結構蛋白組成的多聚蛋白，可進一步被蛋白酶加工成病毒所需的各種功能蛋白。針對這些蛋白的功能，眾多學者設計特異的siRNA，進行了抑制豬瘟病毒增殖的研究。

Npro是豬瘟病毒編碼的第一個蛋白，若Npro基因表達被抑制，則整個ORF中位于Npro下游的基因將不能表達。NS5B是病毒復制酶，具有RNA依賴的RNA酶活性，是RNA聚合酶復合體的核心成分，如果豬瘟病毒的NS5B基因的表達被抑制，則會抑制病毒基因組RNA的復制。徐興然等［5］根據豬瘟病毒Shimen株Npro和NS5B基因序列，設計豬瘟病毒特異的siRNA，通過體外轉錄獲得了這兩個基因的siRNA：siN1、siN2、si5B1和對照siCtrl，制備的siRNA轉染PK-15細胞后感染豬瘟病毒，real-time RT-PCR和TCID50檢測表明siN1、siN2和si5B1能有效地抑制豬瘟病毒的增殖，且其維持時間為72h～84h，72h～84h后病毒增殖才會增加。王鐵東等［6］針對豬瘟病毒石門株Npro基因mRNA的shRNA（短發(fā)夾RNA）逆轉錄病毒表達載體，轉導豬胚胎成纖維細胞，獲得穩(wěn)定整合shRNA表達構件的豬胚胎成纖維細胞株，接種CSFV后，間接免疫熒光分析及子代病毒滴度檢測證實針對所構建的Npro基因的shRNA逆轉錄病毒整合細胞基因組后轉錄產生的siRNA可有效抑制CSFV復制。NS2-3基因編碼的蛋白被加工后形成的p80蛋白在病毒的生命活動中起著重要的作用。冶貴生、張彥明、徐浩等［7］成功構建靶向豬瘟病毒NS3基因shRNA干擾載體，取得可喜進展。

近年來研究結果表明，siRNA可以作為一種候選的防治豬瘟病毒的有效制劑，雖不能清除病毒或完全抑制病毒，但通過抑制病毒快速增殖，有效激發(fā)機體免疫，可使機體及時建立特異性免疫，為研制抗CSFV新型藥物提供一定的參考依據。

4.2 RNAi技術在豬繁殖與呼吸綜合征方面的研究

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起的一種高度接觸性傳染病，呈地方流行性和持續(xù)性感染，由于PRRSV遺傳變異較快，現有疫苗免疫效果較差，目前該病難以控制根除，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約為15kb，含有9個開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。其中ORF1a和ORF1b編碼病毒的非結構蛋白，ORF2～ORF7編碼病毒的結構蛋白。

PRRSV基因組羧基端ORF7編碼核衣殼蛋白N，N蛋白是形成病毒衣殼的惟一蛋白，在組裝和釋放中發(fā)揮重要作用。賀云霞等［8］針對PRRSV的ORF7，設計了4個發(fā)夾結構前體（shRNA）表達盒，分別克隆在鼠U6啟動子下，連入pBluscript載體，同時設立無相關序列的shRNA表達盒（pBC）作為對照。分別與pEN-7共轉染293T細胞，篩選有效干擾序列，同時還使用帶表達盒的PCR產物與pEN-7共轉染293T細胞，結果與shRNA表達載體吻合。攻毒試驗證明shRNA特異地抑制了病毒的復制，免疫熒光和定量PCR結果同樣表明干擾效果顯著。曹素芳等［9］針對PRRSV核衣殼蛋白N靶基因序列設計了3對siRNA靶序列，克隆到真核表達載體pSi-lencer 4.1-CMV中，構建靶向N蛋白基因表達的siRNA干擾重組的真核表達載體，并進行相應的鑒定，篩選有效的干擾序列，特異性地抑制甚至阻斷PRRSV核衣殼蛋白N基因的表達，為PRRSV的新型防治技術研究奠定基礎。

非糖基化的膜蛋白（M）是PRRSV主要的結構蛋白之一，與GP5蛋白形成異源二聚體，是構成PRRSV病毒囊膜蛋白的主要組成成分。黃娟等［10］通過靶向PRRSV基因組中的M基因的siRNA來抑制PRRSV在Marc-145細胞中的復制，研究證實shRNA表達質粒特異性的抑制了靶蛋白M和PRRSV的復制，靶向PRRSV基因組M基因的不同區(qū)域的siRNA可以作為控制該病毒傳播的候選策略。

4.3 RNAi技術在禽流感方面的研究

禽流感病毒（AIV）屬正黏病毒科的A型流感病毒屬。AIV是單股負鏈RNA病毒，基因組分成8個大小不同的片段，編碼不同的病毒蛋白，已鑒定出10種蛋白質。其中核殼蛋白（NP）基因、核酸聚合酶（PA）是AIV轉錄與復制所必需的基因，且在各型流感病毒中的序列都相當保守，是目前應用RNAi治療AIV中最為成熟的基因靶位［11］。在體內外試驗中，聯合使用針對NP與PA的siRNA的抗AIV效應均已得到驗證，并已有向臨床發(fā)展的可能。

Ge Q等［11］用與流感病毒基因組保守區(qū)域相應的siRNAs成功的抑制了病毒在細胞或雞胚中的增殖，為利用RNA干擾預防和治療流感病毒奠定了基礎。AIV的聚合酶由PB1、PB2、PA 3種成分組成，這3種蛋白質的共同特點是含有一段特異的親核序列區(qū)，其作用是使這幾種蛋白質在胞漿合成后能順利進入細胞核。操勝等［12］以H5亞型AIV PB2基因為靶序列，設計合成了4對編碼siRNAs的DNA序列。將其克隆到psiRNA-hH1neo載體中，構建siRNAs表達載體，鑒定正確后將重組質粒轉染MDCK細胞，采用G418篩選建立抗性細胞系，在細胞水平篩選出具有高效抑制AIV復制的2個靶位點PB2-1154、PB2-342，為AIV的基因功能研究，抗病毒藥物的開發(fā)和轉基因動物的研究奠定了基礎。

AIV的其他保守基因如：非結構蛋白（NS1）、基質蛋白1（M1）、基質蛋白2（M2），也具有RNAi的靶標的潛力。除此以外，植物產生的siRNA同樣具有RNAi的作用，這為治療動物的AIV提供了新思路與新來源［13］。

4.4 RNAi技術在新城疫方面的研究

新城疫病毒（NDV）是一種有囊膜的單股負鏈RNA病毒，病毒RNA包裹于核衣殼結構中，病毒粒子含有6種結構蛋白，即核衣殼蛋白NP、磷蛋白P、基質蛋白M、融合蛋白F和血凝素-神經氨酸酶HN和RNA依賴的RNA聚合酶L。只有當NP、P、L這3種蛋白同時存在時才具有很高轉錄酶活性，同時NP、P、L基因是新城疫病毒基因組中最保守的。

母連志等［14］構建了針對新城疫病毒NDV NA-1株P基因的RNAi質粒；轉染質粒36h后接種NDV，通過對病毒滴度測定、實時熒光定量PCR和細胞病變結果分析，表明其能抑制NDV在雞胚成纖維細胞（CEF）中的復制和增殖。岳華等以NP基因為標靶構建細胞內表達發(fā)夾樣結構小于擾RNA的質粒載體，在雞胚成纖維細胞（CEF）和雞胚上進行了RNAi試驗，證實在CEF中存在RNAi機制，抑制NDV NP基因的表達能有效阻斷該病毒增殖。此外，胡順林等分離具有感染性的新城疫病毒粒子后將綠色熒光蛋自基因導入新城疫病毒基因組并得到成功表達，熒光顯微鏡下可見明顯的綠色熒光，這為進一步利用該病毒進行其它外源基因的表達及新型重組疫苗的研制奠定了基礎。

4.5 RNAi技術在狂犬病方面的研究

狂犬病病毒（RV）是一種能引起人和動物高度致死性疾病的嗜神經病毒。RV基因組為不分節(jié)段的單股負鏈RNA，大小為12kb左右，含N、P、M、G、L 5種結構基因［15］。

狂犬病病毒siRNA研究已取得了一定進展，張守峰等［16］針對RV的G、N、L基因，設計小干擾RNA，獲得2個抑制效率高的siRNA，其中有一個是針對N基因19位的siRNA；其次，Brandao P E等［17］針對RV的N基因保守區(qū)合成siRNA，用轉染試劑Lipofectamine 2000瞬時轉染BHK細胞，使病毒滴度比對照大約降低了5倍。

N蛋白在各病毒株間高度保守，不同株系N蛋白的氨基酸同源性在98%～99.6%。現已證實N蛋白在病毒復制過程中與RNA結合成核糖核酸蛋白（RNP），保護RNA免遭核酸酶的破壞和對病毒RNA的免疫應答，并能維護轉錄所需要的RNA螺旋對稱結構［18］。楊瑞梅等［19］以RV的N基因為靶向目標，設計合成4對編碼siRNA的DNA，轉染BHK細胞，證實了靶向狂犬病病毒N基因shRNA能有效干擾RV的復制序列。王繼麟等［20］分別采用體外轉錄和RNA酶Ⅲ消化長片段雙鏈RNA的方法制備了8條以狂犬病毒（RV）PV株N基因作為靶基因的21nt小干擾RNA和RV-N基因小干擾RNA庫，并證實不同21nt小干擾RNA均對狂犬病毒PV株產生了程度不同的強抑制作用。同時還證明在21nt小干擾RNA與靶mRNA堿基錯配高達5個的情況下仍對病毒保持高抑制率。這一結果為我們提出了RNAi抑制作用的廣譜性，偏靶效應等問題，并為設計獨特的siRNA序列提供了依據。

5 問題與展望

當前對基因功能復雜性的認識仍然不夠，尤其對外源基因表達的時空性的控制很難準確操縱，當一些蛋白的表達受抑制時，其他相關補償途徑可能被激活。Grimm D等［21］完成的一項動物試驗發(fā)現，當部分試驗小鼠被注射了大劑量RNAi技術中常用的短發(fā)夾RNA（shRNA）后，其細胞的正常RNA功能受到干擾，嚴重者甚至因此而死亡。這表明采用特定RNA干擾技術治療的試驗鼠，可能會導致肝功能衰竭死亡或產生并發(fā)癥，應用RNA干擾進行基因治療時一定要更加謹慎。有關RNAi技術安全性問題的疑慮早已存在，科學家們曾經報道，RNAi技術有可能關閉非目標基因，或者觸發(fā)細胞的自身防御機制，如干擾素反應等，而這一系列副反應均有可能導致不同程度的機體損害。在應用RNAi時，應注意避免非特異性效應，加強對RNAi效應的調控，不斷優(yōu)化干涉dsRNA片段的獲取方法和導入方式，其他方面，如RNAi抑制效果的持久性與衰減性、輸入途徑、病毒的免疫耐受問題等需要解決［4］。

RNAi的發(fā)現改變了人們對細胞基因調控的傳統(tǒng)思路，提供了特異性阻斷基因表達的新工具，評價基因功能的新策略，為分子生物學技術革命開辟了新領域。盡管其機制仍未完全弄清，但RNAi技術為病毒等尚未根治的疾病提供了新的治療方案，并帶來根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已經日新月異，可以預見隨著RNAi技術的逐步應用，不僅能大大推進人類后基因組計劃的發(fā)展，還有可能設計出RNAi芯片，進而高通量地篩選藥物靶基因和逐條檢測人類基因組的表達抑制情況來明確基因的功能［22］。今后相當長的一段時間內，RNAi是最具潛力和最熱門的研究課題之一。

［1］ Guo S，Kempheus K J.Par-1，agene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser／Thr kinase that is asymmetrically distributed［J］.Cell，1995，81：611-620.

［2］ Fire A，Xu S，Montgomery M K，et al.Potent and specific interference by double-strand RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）：806-811.

［3］ Elbashir S M，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells［J］.Nature，2001，411（6836）：494-498.

［4］ 林少微，王學華，鄭高哲，等.RNAi的研究進展［J］.中國醫(yī)藥導報，2007，29（4）：7-9.

［5］ 徐興然，查云峰，余興龍，等.特異性siRNA抑制豬瘟病毒的增殖［C］。中國畜牧獸醫(yī)學會2004學術年會論文集，2004：959-963.

［6］ 王鐵東，逄大欣，歐陽紅生，等.逆轉錄病毒載體RNAi技術抑制豬瘟病毒在豬胚胎成纖維細胞的增殖［J］.中國農學通報，2009，25（13）：14-17.

［7］ YE Gui-sheng，Zhang Yan-ming，Xu Hao，et al.Construction and identification of recombinant shRNA interference plasmids targeting to NS3gene of classic swine fever virus［J］.J Northwest A＆F University，2007，35（3）：7-10.

［8］ 賀云霞，華榮虹，周艷君，等.PCR擴增的shRNA表達盒快速篩選PRRSV有效siRNA序列［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（5）：376-380.

［9］ 曹素芳，李 明，王 巖，等.靶向PRRSV核衣殼蛋白N基因的siRNA表達載體的構建及鑒定［J］.安徽農業(yè)科學，2009，37（28）：13490-13491，13518.

［10］ Huang Juan，Jiang Ping，Li Yu-feng，et al.Inhibition of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication by short hairpin RNA targeting to M protein gene［J］.Scientia Agricultura Sinica，2008，41（1）：259-264.

［11］ Ge Q，McManus M T，Nguyen T，et al.RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100：2718-2723.

［12］ 操 勝，孟慶文，吳東來，等.通過載體表達siRNAs抑制禽流感病毒復制的研究［J］.科技導報，2006，24（3）：9-13.

［13］ Zhou Y，Chan J H，Chan A Y，et al.Transgenic plant-derived siRNAs can suppress propagation of influenza virus in mammalian cells［J］.FEBS Lett，2004，577（3）：345-350.

［14］ 母連志，丁 壯，叢彥龍，等.利用RNAi技術靶向新城疫病毒P基因抑制其在雞胚成纖維細胞上的復制［J］.中國獸醫(yī)學報，2009，29（7）：841-844.

［15］ 俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2009：215-230.

［16］ 張守峰，李清竹，李 忠，等.細胞水平狂犬病病毒感染的RNA干擾［J］.病毒學報，2006，22（6）：462-465.

［17］ Brandao P E，Castilho J G，Fahl W，et al.Short-interfering RNAs as antivirals against rabies［J］.Braz J Infect Dis，2007，11（2）：224-230.

［18］ Wunner W H，Pallatroni C，Curtis P J.Selection of genetic inhibitors of rabies virus［J］.Arch Virol，2004，l49（8）：1653-1662.

［19］ 楊瑞梅，楊松濤，王承宇，等.靶向狂犬病病毒N基因shRNA抑制狂犬病病毒復制的研究［J］.牧獸醫(yī)學報，2010，41（3）：315-320.

［20］ 王繼麟，朱家鴻，徐葛林，等.用狂犬病毒核蛋白基因小干擾RNA庫抑制狂犬病毒復制和感染的研究［J］.中國病毒學，2006，21（3）：340-347.

［21］ Grimm D，Streetz K L，Jopling C L，et al.Fatality in mice due to oversaturation of cellular micro RNA／short hairpin RNA pathways［J］.Nature，2006，44l（7092）：537-541.

［22］ 李建霞，苗向陽，丁兆忠，等.RNA干擾技術及其應用［J］.中國農學通報，2006，22（12）：5-8.