石文標 謝 明 侯水生黃 葦 喻俊英

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

對于生物學效價，即生物學利用率(bioavailability)，Ammerman 等［1］將其定義為動物食入營養(yǎng)素中能被小腸吸收并參與代謝過程或貯存在動物組織中的部分占食入總量的比值。維生素D是一種必須經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)變才能達到最佳鈣化醇生物活性的脂溶性類固醇衍生物。皮膚合成的維生素D3或小腸吸收的維生素D由維生素D轉(zhuǎn)運蛋白(vitamin D binding protein，DBP)運輸，需在肝臟25－羥化酶(CYP2R1)和腎臟1α－羥化酶(CYP27B1)的催化下經(jīng)2次酶促羥化反應形成最終的活性代謝產(chǎn)物 1，25－二羥基維生素D3［1，25-(OH)2D3］，與維生素 D 受體(vitamin D receptor，VDR)結(jié)合發(fā)揮生物學功能。由此可以看出，維生素D的生物學效價受合成、吸收、轉(zhuǎn)運、催化等過程的影響。近年來，隨著對維生素D在內(nèi)分泌、自分泌/旁分泌、免疫調(diào)節(jié)及信號傳導等功能上的深入研究，其越來越多地作為一種具有激素功能的物質(zhì)被重新認識［2］。因此，從這一新的視角出發(fā)探究維生素D及其類似物的生理機制及生物學效價，對于傳統(tǒng)維生素D研究的進一步發(fā)展是十分必要的。

1 維生素D生物學效價的評定方法

1.1 生物學方法

生物學方法包括“線譜鑒定”技術、外翻腸囊技術和動物活體試驗?！熬€譜鑒定”技術是通過給患有嚴重佝僂病的模型動物飼喂維生素D飼糧一段時間后，對脛骨近端的鈣化程度進行目測評分。此方法很耗時，并且誤差達到30%。外翻腸囊技術一般是通過給維生素D缺乏的動物飼喂1次維生素D，待24 h后測量其腸道內(nèi)鈣轉(zhuǎn)運速率和骨質(zhì)動員速率的變化情況，以此評定維生素D的生物學效價。動物活體試驗是在一定的飼養(yǎng)期內(nèi)，用不同形式的維生素D(通常以維生素D2或維生素D3作為標準物)補飼相同摩爾水平的膽鈣化醇活性基團到試驗飼糧中飼喂試驗動物。試驗結(jié)束后對試驗動物的多項敏感生理指標進行測定，然后用多元線性回歸求斜率比等方法對數(shù)據(jù)進行分析整理，計算出不同形式維生素D間的相對生物學效價。這種方法簡單易行，比較靈敏、準確、客觀，但試驗要求設定一定的濃度梯度，需使用較多的試驗動物，并且所測得的結(jié)果只是相對利用率。由于該方法在使用時動物處于自然生長狀態(tài)，其試驗結(jié)果對生產(chǎn)實際具有指導意義，可作為其他研究方法的參照基準。

1.2 化學方法

化學方法的實質(zhì)是將堿性皂化過程中維生素D的前體物質(zhì)含量列為內(nèi)部標準，通過高效液相色譜、競爭結(jié)合試驗及放射受體分析等一些現(xiàn)代生化分析方法測定每一種維生素D代謝物或類似物的生物學活性，從而達到精確量化維生素D的目的。化學方法的誤差是7% ～8%，但因其需要經(jīng)過堿性水解、液－液萃取和固相萃取樣品清理等繁瑣步驟［3－4］，故此方法也相當費時。由于近10年來對25－羥基維生素D3［25-(OH)D3］生物學效價的研究越來越多，因此這種新的方法成為估測維生素D生物學效價的首選。

2 不同形式維生素D的生物學效價比較

從最初的維生素D3到25-(OH)D3再到最終代謝產(chǎn)物1，25-(OH)2D3，其生物學活性是成倍遞增的。對大多數(shù)哺乳動物來說，維生素D3和維生素D2發(fā)揮著同樣的生物學效應，但在禽類上維生素D3的生物學效價是維生素D2的10～30倍。Armas等［5］研究認為，維生素D2維持人血清25－羥基維生素D［25-(OH)D］水平的效力只有維生素D3的30% ～50%。這與Biancuzzo等［6］的研究結(jié)果并不一致，他們認為維生素D3和維生素D2的生物學效價不相上下，這可能與他們所用維生素D制劑的載體不同有關。Winter等［7］在體內(nèi)和體外的研究試驗表明，在促進腸道鈣轉(zhuǎn)運上維生素D3與25-(OH)D3的生物學效價基本一致。歸納以往的研究結(jié)果［8－10］，維生素D3及其代謝產(chǎn)物的生物學效價對比大體上為維生素D3≤24，25－二羥基維生素 D3［24，25-(OH)2D3］=25，26 － 二羥 基 維 生 素 D3［25，26-(OH)2D3］≤25-(OH)D3≤1，25-(OH)2D3。

3 維生素D生物學效價的影響因素

3.1 影響維生素D生物學效價的內(nèi)在因素

3.1.1 活性維生素D的結(jié)構(gòu)與DBP及VDR的親和性

維生素D3化學結(jié)構(gòu)的改變會導致其與VDR結(jié)合方式的改變，繼而引起VDR構(gòu)象的變化，影響靶基因轉(zhuǎn)錄水平的表達，最終改變維生素D3的生物學效價［11］。DBP作為血清中維生素D代謝產(chǎn)物的主要載體，以3個主要的多態(tài)性形式存在，不同形式的DBP對維生素D的生物學效價有潛在的影響。最近的研究表明，維生素D一些生物學功能的發(fā)揮與血清游離的25-(OH)D濃度關系更緊密，而非這種代謝產(chǎn)物的總濃度［12］。血清25-(OH)D的總濃度相對較低時其游離的25-(OH)D濃度較高，而DBP的高親和性可能導致游離的25-(OH)D濃度的降低［13］。除了運輸功能外，DBP能夠?qū)⒀逯芯S生素D代謝產(chǎn)物的循環(huán)濃度維持在穩(wěn)定水平，而且DBP可延長維生素D及其代謝產(chǎn)物的半衰期，并使得它們更易被靶組織吸收，因此可以影響一些器官的代謝反應，調(diào)節(jié)生物學效價［14］。

維生素D3的結(jié)構(gòu)改造主要包括側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)改造和A環(huán)的結(jié)構(gòu)改造。這些結(jié)構(gòu)的改造及構(gòu)象的修飾能夠改變維生素D與DBP及VDR的親和性，使它們與鈣代謝平衡調(diào)節(jié)、細胞誘導分化和增殖抑制等生物學功能徹底分離，從而影響維生素D的生物學活性。有研究表明，1α－羥基在維生素D與DBP及VDR結(jié)合的過程中至關重要，一些基團取代1α－羥基后，其類似物的生物活性與1，25-(OH)2D3相比均有顯著降低［15－16］。隨C －2位α－羥烷基的碳原子數(shù)增加，類似物的VDR親和性及誘導細胞分化活性逐步升高，其中α－羥丙基的VDR親和性最高，為維生素 D3的3倍［17］。因此，進一步研究活性維生素D3的構(gòu)效關系對于維生素D3生物學效價的研究發(fā)展十分必要。

3.1.2 關鍵酶的活性及其反饋調(diào)節(jié)機制

維生素D的代謝過程中有多種羥化酶發(fā)揮作用，其中起關鍵作用的酶主要是 CYP2R1、CYP27B1和24－羥化酶(CYP24)。它們的活性和基因轉(zhuǎn)錄表達水平可通過正負反饋調(diào)節(jié)機制受不同因素的調(diào)控。肝臟中的CYP2R1被認為是維生素D發(fā)生25－羥基化所需的關鍵酶，CYP2R1基因發(fā)生突變后血清中25-(OH)D3循環(huán)水平降低，并同時出現(xiàn)典型的維生素D缺乏癥狀［18］。血清中25-(OH)D3能夠直接抑制CYP2R1的活性，這種負反饋調(diào)節(jié)機制對于維持穩(wěn)定的血清25-(OH)D3水平非常重要［19］。

CYP27B1影響維生素D代謝產(chǎn)物的生物學效價，低鈣磷飼糧會導致CYP27B1活性的增加［23］，而高鈣低磷飼糧會下調(diào)腎臟CYP27B1基因表達水平，從而說明飼糧鈣對CYP27B1活性的影響較大，而飼糧磷對CYP27B1活性的影響不大［22］。除此之外，甲狀旁腺素(PTH)［20］、降鈣素［21］、催乳素［24］也可通過調(diào)節(jié) CYP27B1 基因的轉(zhuǎn)錄表達而影響1，25-(OH)2D3的合成。而單核細胞和巨噬細胞中CYP27B1的調(diào)節(jié)機制與腎臟有所不同。由巨噬細胞產(chǎn)生的CYP27B1其基因受免疫刺激物(如γ－干擾素和脂多糖)的刺激通過多種途徑［如Janus激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核轉(zhuǎn)錄因子－κB(NF-κB)］而上調(diào)表達。免疫刺激也需要 CCAAT/增強子結(jié)合蛋白 β(C/EBPβ，又稱NF-IL6)結(jié)合到CYP27B1啟動子區(qū)域的識別位點上才能實現(xiàn)對其轉(zhuǎn)錄的激活［25－26］。這表明動物體的自身免疫狀態(tài)可以通過調(diào)控某些免疫細胞中CYP27B1基因的轉(zhuǎn)錄表達來影響維生素D代謝，從而影響維生素D的生物學效價。

腎臟中的CYP24可以羥基化25-(OH)D3和1，25-(OH)2D3，其主要功能是降低維生素D的生物學活性。CYP24與1，25-(OH)2D3之間是相互調(diào)節(jié)的，1，25-(OH)2D3刺激CYP24活性增強，而低鈣和低PTH抑制其活性。有研究表明，胎盤中CYP24活性的降低可導致胎兒－母體接口處1，25-(OH)2D3生物學效價的增加［27］。而轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ、SWI/SNF、輔活化子結(jié)合精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(CARM1)和G9可與VDR共同作用于CYP24的轉(zhuǎn)錄調(diào)控［28－30］，成纖維細胞生長因子23(fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23)和 klotho蛋白也可通過調(diào)節(jié)CYP27B1與CYP24基因的表達而參與1，25-(OH)2D3的自動抑制調(diào)節(jié)，從而影響其生物學功能的發(fā)揮［31］。

3.2 影響維生素D生物學效價的外在因素

3.2.1 試驗動物及光照

不同種類的動物對維生素D的吸收利用能力差異很大。維生素D2和維生素D3的生物學效價在不同物種中所測得的結(jié)果存在一定的差異，而動物的自身狀況(如免疫狀態(tài)［32］、年齡［33］、肥胖［34］等)也與維生素D的生物學效價有關。皮膚中的7－脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射形成維生素D3前體，進而轉(zhuǎn)化成維生素D3。紫外線光照的變化顯著影響這一過程，進而影響維生素D生物學效價的測定。有研究利用電腦建模技術估測，1單位最小紅斑劑量(MED)的紫外線光照在人體中可以產(chǎn)生相當于口服16 000 IU維生素D的效力［38］。肉雞光照試驗結(jié)果表明，皮膚經(jīng)紫外線照射所產(chǎn)生的膽鈣化醇量相當于飼喂10 μg/kg的25-(OH)D3［40］或 20 μg/kg 的維生素 D3［39］。因此，紫外線照射強度的不同也是導致維生素D生物學效價沒有一致結(jié)論的因素之一。

3.2.2 評價指標及評價方法

在維生素D生物學效價的研究試驗中，采用不同的測定方法及指標所測得的結(jié)果不同，生物學方法所測得的結(jié)果比化學方法要低20%左右。不同的試驗采用的指標各異，主要包括生產(chǎn)性能指標(體重、日增重、采食量和料肉比)、脛骨指標(骨灰分和骨鈣磷)、血清指標［鈣磷水平、25-(OH)D水平、堿性磷酸酶活性］、鈣吸收代謝指標(腸道鈣轉(zhuǎn)運速率、骨鈣動員速率)等。近年來，血清PTH水平也被作為評定維生素D生物學效價的指標之一［35－36］。Emily 等［37］在鼠上測定維生素D2與維生素D3生物學效價時發(fā)現(xiàn)，以血清25-(OH)D水平為評價指標時維生素D2的生物學效價低于維生素D3，而以骨礦物質(zhì)密度、骨礦物質(zhì)含量等為評價指標時這兩者基本相等。因此，評價指標及評價方法的選擇對于評價維生素D的生物學效價特別重要。

3.2.3 維生素D載體

飲食中維生素D的載體是不同的，一般包括油、粉末及乙醇。載體對維生素D的生物學效價有非常重要的影響［41］。有研究報道，乳糖作為維生素D載體時其效價是油的1.09倍［42］，是纖維素的1.42倍［43］;而油作為維生素 D載體時其效價是乙醇的 4.25 倍［44］，是多維的 1.13 倍［45］。乳脂性食品是維生素D理想的載體，因為其所含的脂肪成分可以增強脂溶性維生素D的穩(wěn)定性，促進其吸收［46］，尤其是奶酪制品中所含的β－乳球蛋白和β－酪蛋白，能夠強力結(jié)合維生素D，形成保護性的結(jié)構(gòu)，避免在極性環(huán)境中被破壞，從而影響了維生素 D 的生物學效價［47－48］。

4 小結(jié)

隨著維生素D生物學效價評定方法的不斷完善及快速普及，研究的結(jié)果也逐步呈現(xiàn)出一致性，但由于某些影響因素的存在導致了一定的差異性，對維生素D生物學效價的研究仍然沒有統(tǒng)一的結(jié)論。因此，確定一個最合適的評價體系是今后研究的重點。此外，隨著流行病學、動物學、細胞學、生物化學以及分子遺傳學研究的進展，人們對維生素D的生物學功能有了更深一步的認識，這為從細胞水平和分子水平上探究維生素D生物學效價新的評定方法提供了可能。

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