董麗，郭惠珊

中國科學(xué)院微生物研究所 植物基因組學(xué)國家重點實驗室，北京 100101

2006年，美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Craig C. Mello和斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Andrew Z. Fire因在RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 研究領(lǐng)域中的杰出貢獻而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。這一事件確立了RNA干擾在真核生物基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的主導(dǎo)地位。RNA干擾，又稱RNA沉默 (RNA silencing)，是一種具有核苷酸序列特異性的，能夠?qū)е翿NA降解，蛋白翻譯抑制，DNA甲基化，以及異染色質(zhì)形成的表觀遺傳學(xué)效應(yīng)。RNA沉默現(xiàn)象廣泛存在于植物、真菌、渦蟲、錐蟲、果蠅、大鼠、人等真核生物中。自1990年人類發(fā)現(xiàn)RNA沉默現(xiàn)象至今，20多年的探索使植物RNA沉默的理論體系日臻成熟和完善。

1 轉(zhuǎn)錄后基因沉默 (Post-transcriptional gene silencing，PTGS)

1.1 RNA沉默的發(fā)現(xiàn)

RNA沉默的發(fā)現(xiàn)最早可以追溯到1990年。Jorgensen等向矮牽牛中導(dǎo)入粉紅色素合成相關(guān)基因，預(yù)期產(chǎn)生顏色更深的紫色牽?；ǎY(jié)果發(fā)現(xiàn)許多花朵的顏色變成白色或花白色。分析表明：導(dǎo)入的基因與內(nèi)源粉紅色素基因同時被沉默，所以被稱為共抑制 (Co-suppression)[1]。這一現(xiàn)象與真菌中的壓制 (Quelling)[2]和動物中的RNA干擾 (RNA interference，RNAi)[3]類似，都是以靶標(biāo) mRNA的降解為特征，所以又被稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默 (Post-transcriptional gene silencing，PTGS)。植物中的 PTGS主要過程如下：外源轉(zhuǎn)基因mRNA在一種依賴于RNA的RNA聚合酶 RDR6 (RNA DEPENDENT RNA POLIMERASE6) 的作用下形成雙鏈 RNA (dsRNA)，再由一種 RNA酶 III蛋白——Dicer或Dicer-like (DCL，植物中以DCL4為主) 切割，產(chǎn)生21 nt小干擾RNA (Small interference RNA，siRNA)，siRNA 進入含有Argonaut 蛋白 (AGO)的 RISC 復(fù) 合 體 (RNA-induced silencing complex)[4-5]，介導(dǎo)與 dsRNA 有序列相似性的mRNA的降解[4,6-7]。之后，RDR6又以siRNA為引物，外源mRNA為模板，合成新的dsRNA，在 DCL作用下產(chǎn)生更多的次級 siRNA；次級siRNA的再循環(huán)使沉默信號得以擴增，在宿主中產(chǎn)生系統(tǒng)性的沉默。

1.2 內(nèi)源PTGS途徑

外源RNA誘導(dǎo)RNAi的發(fā)現(xiàn)促使人們尋找內(nèi)源性RNAi的存在。第一個內(nèi)源小RNA——線蟲lin4，是在1993年發(fā)現(xiàn)的[8]；時隔7年，線蟲中另一個長度為21 nt的let7 RNA被發(fā)現(xiàn)[9]；此后，科研工作者們相繼在線蟲、Hela細胞、果蠅、擬南芥等許多真核模式生物和細胞中找到了數(shù)百種相似的小分子 RNA，并將其稱為 miRNA (microRNA)。這些miRNA在各種生物中對靶標(biāo)RNA的調(diào)節(jié)功能也很保守[10]。miRNA，一般長度為21~22 nt，是由非編碼RNA折疊所形成的、短的、不完全配對的莖環(huán)結(jié)構(gòu)經(jīng)DCL1切割后產(chǎn)生的，小RNA進入AGO1復(fù)合體，介導(dǎo)mRNA的降解、翻譯后水平的調(diào)控[11-13]。通過 miRNA途徑，生物體能夠動態(tài)的調(diào)節(jié)編碼基因的表達水平，以適應(yīng)不同發(fā)育時期和應(yīng)對外界環(huán)境刺激的需要。

植物體內(nèi)還存在另外一種參與 PTGS的小RNA——反式作用siRNA (Trans-acting siRNA，ta-siRNA)。ta-siRNA途徑中的主要環(huán)節(jié)就是次級siRNA的生成[14]。ta-siRNA的前體是一類來源于TAS (ta-siRNA transcript) 基因的非編碼轉(zhuǎn)錄本。ta-siRNA的產(chǎn)生需要miRNA的參與，miRNA介導(dǎo)的 TAS基因裂解之后，部分殘留的轉(zhuǎn)錄本被RDR6轉(zhuǎn)化為dsRNA。dsRNA經(jīng) DCL4切割產(chǎn)生ta-siRNA，ta-siRNA介導(dǎo)其他靶標(biāo)基因，而非TAS基因的降解，故此被稱為反式siRNA[15-18]。

nat-siRNA (Natural antisense transcripts siRNA) 途徑也是植物內(nèi)源PTGS途徑的一個重要組成部分。擬南芥基因組編碼2 000多個自然的順-反義基因?qū)?，這些內(nèi)源的順-反義基因轉(zhuǎn)錄自不同的DNA鏈，各自的轉(zhuǎn)錄本在3￠末端互補。通常情況下，其中一個基因是組成型表達的，另一個基因僅在特定脅迫條件下被誘導(dǎo)表達，二者形成dsRNA。dsRNA作為DCL的底物，被切割成21~24 nt nat-siRNA。nat-siRNA靶向降解順-反義基因的一個轉(zhuǎn)錄本，裂解的RNA分子又借助于RDR6和SGS3 (SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3) 的功能被轉(zhuǎn)化成 dsRNA。然后RDR6/SGS3合成的dsRNA分子被DCL處理成nat-siRNA，進而被用于介導(dǎo)同源 mRNA的沉默[19]。目前的研究結(jié)果表明：DCL1、DCL2、DCL4可能在不同的基因?qū)φ{(diào)控中發(fā)揮各自的作用[20-22]。

1.3 RNAi技術(shù)

隨著PTGS途徑研究的深入，RNAi技術(shù)應(yīng)運而生。RNAi技術(shù)就是利用人工方法向宿主中引入沉默誘導(dǎo)因子，達到降解靶基因轉(zhuǎn)錄本的目的。常用的方法有很多，如將體外合成的siRNA，或包含其序列的dsRNA，用注射等方法導(dǎo)入宿主細胞中；或者，在宿主體內(nèi)表達與目的基因相關(guān)的 miRNA的前體序列或反向重復(fù)RNA (Invert repeat RNA，IR-RNA)，誘導(dǎo)靶基因mRNA降解。再有，研究發(fā)現(xiàn)植物病毒侵染會誘導(dǎo)基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)。利用VIGS原理，將目的基因與病毒載體重組，用以侵染植物也能誘導(dǎo)靶標(biāo)基因的沉默。IR-RNA法穩(wěn)定、易行；病毒侵染法高效、周期短。因此，二者經(jīng)常被用于基因敲除和RNA沉默機制的研究中。

2 轉(zhuǎn)錄基因沉默

2.1 植物內(nèi)源RdDM途徑

除了PTGS，植物體內(nèi)還存在一種與小RNA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄基因沉默 (Transcriptional gene silencing，TGS)[23-25]。由于這里的TGS與DNA甲基化相關(guān)，因此相應(yīng)的機制被定義為RNA介導(dǎo) 的 DNA 甲 基 化 (RNA-directed DNA methylation，RdDM)[26]。RdDM途徑是植物特有的維持基因組穩(wěn)定性的機制，其靶點主要是轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列和編碼短RNA的基因間區(qū)[27]。利用遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法，人們已經(jīng)分離出很多參與RdDM途徑的調(diào)控元件。這些元件在以下3個方面的一個或多個點上行使功能：hc-siRNA (Heterochromatic siRNA) 的合成；腳手架 RNA (Scaffold RNA) 的合成；參與siRNA和新生腳手架 RNA互補配對的效應(yīng)復(fù)合體的排布以招募DNA甲基化酶。

siRNA (以24 nt為主)的合成需要Pol IV (RNA polymerase IV)、RDR2和DCL3的參與[28-32]。而腳手架RNA是由RNA聚合酶Pol V或者Pol II合成的[33-37]。與Pol V相比，Pol II傾向于合成基因間區(qū)低拷貝重復(fù)位點相關(guān)的腳手架RNA[37]。不同的RNA聚合酶在RdDM過程中協(xié)同作用。Pol II合成的腳手架轉(zhuǎn)錄本可能有助于招募Pol IV和Pol V到RdDM靶點，分別促進siRNA的生成或DNA甲基化。Pol V合成腳手架 RNA的過程需要染色質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白DRD1 (DEFECTIVE IN RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 1)、染色質(zhì)鉸鏈結(jié)構(gòu)域蛋白DMS3 (DEFECTIVE MERISTEM SILENCING3) 和 RDM1 (RNA-DIRECTED DNA METHYLATION1) 的參與[36-40]；而Pol II合成腳手架 RNA需要 DRD1，但不需要DMS3[37]，是否需要RDM1還未經(jīng)查考。siRNA和腳手架RNA配對及DNA甲基化酶的招募過程則由AGO4、AGO6或者AGO9、DRD1、Pol V、DMS3 (DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING3)、RDM1和 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2 (DOMAINS REARRANGED METHYLASE2) 負責(zé)[27,38-39,41-45]。細胞學(xué)分析結(jié)果表明：植物中RdDM途徑對于靶位點的沉默調(diào)控具有時空分布的特點。高度重復(fù)序列主要聚集于核仁周邊區(qū)，被Pol V介導(dǎo)的RdDM沉默。而對于基因間低拷貝位點，則有兩種情況：分布在核仁周邊區(qū)的，被依賴于 Pol V的RdDM 沉默；散布于核質(zhì)中的，則成為依賴于Pol II的RdDM沉默靶點[36-37,46]。

目前在擬南芥中還發(fā)現(xiàn)2個反向重復(fù)序列與通常用于RNAi的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)極其相似，有對應(yīng)的靶點，均能產(chǎn)生21~24 nt的siRNA。其中至少IR71的siRNA能被招募到AGO復(fù)合體中介導(dǎo)自身和靶基因的PTGS和RdDM。嫁接實驗表明，這些siRNA能夠進行長距離運輸，并能在目標(biāo)組織中介導(dǎo)RdDM[47]。

2.2 轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的TGS

盡管 RdDM途徑是植物特有的維持基因組穩(wěn)定性的機制，但該途徑最早是在轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)沉默實驗中被發(fā)現(xiàn)的[23-25]。利用與啟動子同源的序列構(gòu)建IR轉(zhuǎn)基因載體，在植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物在細胞核里被加工成24 nt siRNA后，能夠介導(dǎo)相應(yīng)區(qū)域的DNA甲基化，從而抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。植物中，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因和編碼蛋白的內(nèi)源基因的TGS效率有很大差別[48]。植物基因組中的轉(zhuǎn)基因很容易被沉默，而且無論有無沉默誘導(dǎo)子，沉默狀態(tài)都可以遺傳[24]。而內(nèi)源編碼基因只有在誘導(dǎo)子存在的情況下才能被沉默，而且沉默效率遠遠低于轉(zhuǎn)基因[49-50]。這一特點暗示：盡管存在誘導(dǎo)因子 (24 nt siRNA)，RdDM途徑也不大可能作用于內(nèi)源編碼基因。

3 RNA沉默的傳遞

在植物中，沉默只有向起始細胞以外傳遞，才能更有效地抑制靶基因表達[51-52]。沉默的傳遞包含3個層面：沉默信號的擴增、傳遞和接收。

現(xiàn)已證明：雙鏈siRNA是RNA沉默的信號之一[53-54]。DCL3或DCL4生成的siRNA通過胞間連絲在細胞間運動；通過韌皮部進行長距離運輸，形成系統(tǒng)性沉默。運動的 21 nt siRNA 與AGO1結(jié)合，介導(dǎo)PTGS[6,53,55]；而運動的24 nt siRNA可能與AGO4、AGO6或AGO9結(jié)合，介導(dǎo)DNA甲基化或與轉(zhuǎn)錄基因沉默相關(guān)的染色質(zhì)修飾[43,45]。兩種小RNA在信號接收組織中都可能利用RNA聚合酶Pol IV或RDR的功能，起始信號的擴增過程[56-57]。然而，目前還不能排除siRNA前體RNA，例如dsRNA作為信號的可能。

一般情況下，初級小RNA對靶基因轉(zhuǎn)錄本的積累僅具有微調(diào)作用，例如大部分miRNA與靶 mRNA的關(guān)系；若要得到更強的沉默效果，有賴于次級siRNA的合成，即信號的擴增過程。次級siRNA分為兩類，一類是與原始激發(fā)子，如dsRNA相關(guān)的siRNA的再生產(chǎn)；另一類來自于原始靶標(biāo)區(qū)段的兩側(cè) (此現(xiàn)象即所謂的“沉默的漂移”)。二者的生成均需要 RDR6的功能和靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[58-60]。而在 TGS過程中，信號擴增伴隨著次級24 nt siRNA的產(chǎn)生和啟動子區(qū)甲基化的擴展，這一過程是通過依賴于 Pol IV-RDR2-DCL3的RdDM途徑逐步完成的。在RdDM途徑突變體rdr2，nrpd1 (NRPD1是Pol IV的大亞基)和dcl3中，次級siRNA消失，DNA甲基化水平明顯下降。Daxinger等在其所使用的外源轉(zhuǎn)基因 TGS沉默系統(tǒng)中還發(fā)現(xiàn)：甲基化的擴展是從靶點區(qū)向下游單向延伸的[61]。

除了信號的擴增和傳遞過程，植物內(nèi)源可能還存在一個信號接收系統(tǒng)，以便更好地協(xié)調(diào)整個沉默過程。在外源轉(zhuǎn)基因GFP沉默系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)：RdDM途徑的重要元件NRPD1、RDR2和DCL3以及RDR6可能參與長距離mRNA沉默的信號接收過程[56]。

4 植物內(nèi)源編碼基因RNA沉默的研究

在自然狀態(tài)下，植物利用miRNA、ta-siRNA和nat-siRNA等途徑，適應(yīng)不同生理或外界環(huán)境的需要，對部分編碼基因的活性進行調(diào)節(jié)。大部分活躍表達的蛋白編碼基因不受 PTGS或 TGS沉默途徑的調(diào)節(jié)。當(dāng)人們利用RNAi手段，向植物中轉(zhuǎn)入外源誘導(dǎo)因子，誘導(dǎo)內(nèi)源蛋白編碼基因沉默時發(fā)現(xiàn)：無論誘導(dǎo)PTGS還是TGS，都不能得到預(yù)期的效果，更不能產(chǎn)生系統(tǒng)性沉默。內(nèi)源基因只有置于轉(zhuǎn)基因構(gòu)建中，作為轉(zhuǎn)基因來表達，方能被有效地沉默[23,48,62]。然而，利用RNA病毒攜帶啟動子區(qū)片段，建立針對內(nèi)源基因的VIGS體系，則沉默效果大大加強[63]。這是因為病毒自身的復(fù)制及其在細胞間和系統(tǒng)性的擴散，使沉默誘發(fā)子 (啟動子區(qū)片段) 也同時被不斷的擴增，從而增強對內(nèi)源基因的沉默效應(yīng)。

由于植物內(nèi)源基因很難被沉默，而以往的沉默研究大多借助于外源系統(tǒng)，不能完全體現(xiàn)內(nèi)源編碼基因在面對沉默誘導(dǎo)因子時的原初反應(yīng)。因此，對于植物是通過何種方式調(diào)控和避免內(nèi)源蛋白編碼基因的RNA沉默，目前所知甚少。郭惠珊研究員等[64]早期通過一個可誘導(dǎo)的 PDS (Phytoene desaturese) 基因沉默系統(tǒng) (PDSi，包含有沉默誘發(fā)子) 的研究，使這一問題露出了冰山一角。研究發(fā)現(xiàn)：在可誘導(dǎo)沉默的植株中，沉默誘發(fā)子誘導(dǎo)的內(nèi)源 PDS基因沉默僅限于局部被誘導(dǎo)的組織和極少量系統(tǒng)葉片，不能傳遞到整個植株[64]。我們近期將PDSi株系與RdDM途徑相關(guān)突變體drd1、nrpd2和nrpe1進行雜交，發(fā)現(xiàn)在這些基因功能缺失背景下，PDS沉默表型增強。分子遺傳學(xué)分析結(jié)果表明：在野生型 PDSi植株中，siRNA的合成，DNA甲基化及其從轉(zhuǎn)錄區(qū)向啟動子區(qū)的傳遞，這些過程都只發(fā)生在外源沉默誘發(fā)子結(jié)構(gòu)上，而內(nèi)源 PDS靶點不受影響。在3個RdDM突變體中，外源沉默誘發(fā)子轉(zhuǎn)錄本及相應(yīng)的siRNA大量積累，甲基化水平顯著低于野生型PDSi株系。我們的實驗結(jié)果暗示：植物通過RdDM途徑，加強外源沉默誘發(fā)子的自我沉默，從而阻止沉默信號的繼續(xù)產(chǎn)生，有效地抑制了由沉默誘發(fā)子誘導(dǎo)的內(nèi)源靶基因轉(zhuǎn)錄本的沉默。我們的研究揭示了植物對編碼基因正常表達的一種自我保護機制；同時也解釋了利用RNAi手段誘導(dǎo)內(nèi)源編碼基因沉默經(jīng)常無法達到預(yù)期沉默效果這一普遍現(xiàn)象背后的原因。

5 植物中的“自我識別系統(tǒng)”

已有的研究結(jié)果表明：盡管與沉默誘發(fā)子存在序列同源性，內(nèi)源功能基因很難被沉默[23]。我們的研究揭示：誘導(dǎo)內(nèi)源編碼基因沉默的低效率，與沉默過程中內(nèi)源靶標(biāo)上不能產(chǎn)生次級siRNA和DNA的從頭甲基化直接相關(guān)[65]。次級siRNA的產(chǎn)生與RDR6等相關(guān)，DNA的從頭甲基化則依賴于RdDM途徑，這兩者均不能作用于內(nèi)源編碼基因[6,27,62]。這些現(xiàn)象都表明：植物體內(nèi)可能存在一種天然的“自我識別系統(tǒng)”，這是植物利用基因沉默系統(tǒng)避免自身被沉默的最基本的保障。無論對于RdDM相關(guān)的TGS過程，還是在依賴于RDR6的PTGS擴展過程，“自我識別”都至關(guān)重要。然而，迄今為止，人們?nèi)晕唇议_“植物自我識別系統(tǒng)”的神秘面紗。有研究者認為：這可能與DNA的甲基化水平相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)：與內(nèi)源靶基因不同，外源轉(zhuǎn)基因DNA結(jié)構(gòu)有一定程度的甲基化，這可能就是植物識別“自己”或“異己”基因組的重要標(biāo)志之一[65]。另外，T-DNA本身可能具有與重復(fù)序列或病毒相似的DNA區(qū)段 (例如，通常所用的35S啟動子本身就來源于病毒)；或者其插入位點常常與重復(fù)序列相毗鄰，導(dǎo)致其更容易被RdDM途徑沉默[66]。

簡言之，植物利用基因沉默機制維持自身基因組的穩(wěn)定性，是通過PTGS和TGS途徑雙管齊下的。對于常規(guī)表達的基因，主要通過miRNA、ta-siRNA和nat-siRNA等沉默途徑進行微調(diào)；對于內(nèi)源轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列，則利用siRNA介導(dǎo)的甲基化途徑使其保持低活性狀態(tài)；對于轉(zhuǎn)基因或病毒等外源DNA或RNA結(jié)構(gòu)，植物一方面通過PTGS降解相關(guān)RNA，另一方面利用RdDM途直接造成其轉(zhuǎn)錄沉默，從而緩解了其對內(nèi)源功能基因的PTGS作用。從作用機制上講，后兩者有很多的相似之處。這可能是由于它們具備共同的結(jié)構(gòu)特點，均能被植物的“識別系統(tǒng)”檢測出來的緣故。

6 展望

每一種生物都具有特定的基因組，然而，生物基因組是如何在億萬年的遺傳與變異中，保持相對穩(wěn)定呢？RNA沉默現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)與研究，為人類認識這一問題提供了一個新的視角。RNA沉默能夠抑制外源DNA入侵 (病毒、轉(zhuǎn)基因)[67]；保持內(nèi)源轉(zhuǎn)座子、重復(fù)序列等的低活性[68-69]；在發(fā)育過程中調(diào)節(jié)基因表達[70-71]，是一種重要的基因組免疫機制。

盡管近年來的研究成果豐富了我們對于RNA沉默的知識，然而新的問題不斷產(chǎn)生，原有問題仍然存在。例如，PTGS和TGS途徑中更多調(diào)控元件有待發(fā)現(xiàn)；與基因沉默信號傳遞直接相關(guān)的調(diào)控因子一直沒有找到；在基因組中，什么特征決定了一個位點是否能產(chǎn)生 21~22 nt或24 nt的siRNA？植物內(nèi)源系統(tǒng)如何識別“自己”和“異己”的DNA分子，從而特異地阻擊外源DNA的進攻？

盡管植物如何識別外源 DNA結(jié)構(gòu)尚不清楚，但是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)遇到以下現(xiàn)象已經(jīng)不足為奇了：用來研究基因功能的過量表達轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，處于內(nèi)源RdDM沉默途徑監(jiān)控之下，其真正的過表達功能難以發(fā)揮，常常產(chǎn)生共抑制現(xiàn)象；反之，用于敲除內(nèi)源基因功能的RNAi構(gòu)建，其表達也受RdDM途徑的抑制，只能在起始部位發(fā)揮作用，難以向周圍組織傳遞。而長期以來，人們用以研究基因沉默途徑的系統(tǒng)往往與轉(zhuǎn)基因技術(shù)有著千絲萬縷的聯(lián)系，所得出的部分結(jié)論可能還有待于后人的重新思索和驗證。

[1] Jorgensen R. Altered gene expression in plants due to trans interactions between homologous genes. Trends Biotechnol, 1990, 8: 340?344.

[2] Cogoni C, Romano N, Macino G. Suppression of gene expression by homologous transgenes. Antonie Van Leeuwenhoek, 1994, 65(3): 205?209. [3] Fire A, Xu SQ, Montgomery MK, Kostas SA, et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 1998, 391(6669): 806?811.

[4] Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev, 2001, 15(2): 188?200.

[5] Hammond SM, Bernstein E, Beach D, et al. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature, 2000, 404(6775): 293?296.

[6] Dunoyer P, Himber C, Voinnet O. DICER-LIKE 4 is required for RNA interference and produces the 21-nucleotide small interfering RNA component of the plant cell-to-cell silencing signal. Nat Genet, 2005, 37(12): 1356?1360.

[7] Hamilton AJ, Baulcombe DC. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science, 1999, 286(5441): 950?952.

[8] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 1993, 75(5): 843?854.

[9] Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature, 2000, 403(6772): 901?906.

[10] Pasquinelli AE, Reinhart BJ, Slack F, et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature, 2000, 408(6808): 86?89.

[11] Chen XM. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science, 2004, 303(5666): 2022?2025.

[12] Llave C, Kasschau KD, Rector MA, et al. Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants. Plant Cell, 2002, 14(7): 1605?1619.

[13] Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, et al. MicroRNAs in plants. Genes Dev, 2002, 16(13): 1616?1626.

[14] Vaucheret H. MicroRNA-dependent trans-acting siRNA production. Sci STKE, 2005, 2005(300): pe43.

[15] Yoshikawa M, Peragine A, Park MY, et al. A pathway for the biogenesis of trans-acting siRNAs in Arabidopsis. Genes Dev, 2005, 19(18): 2164?2175.

[16] Xie ZX, Allen E, Wilken A, et al. DICER-LIKE 4 functions in trans-acting small interfering RNA biogenesis and vegetative phase change in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(36): 12984?12989.

[17] Makarova KS, Wolf YI, van der Oost J, et al. Prokaryotic homologs of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements. Biol Direct, 2009, 4(1): 29.

[18] Allen E, Xie ZX, Gustafson AM, et al. microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants. Cell, 2005, 121(2): 207?221.

[19] Eamens A, Wang MB, Smith NA, et al. RNA silencing in plants: yesterday, today, and tomorrow. Plant Physiol, 2008, 147(2): 456?468.

[20] Borsani O, Zhu JH, Verslues PE, et al. Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis-antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell, 2005, 123(7): 1279?1291.

[21] Katiyar-Agarwal S, Gao S, Vivian-Smith A, et al. A novel class of bacteria-induced small RNAs in Arabidopsis. Genes Dev, 2007, 21(23): 3123?3134.

[22] Katiyar-Agarwal S, Morgan R, Dahlbeck D, et al. A pathogen-inducible endogenous siRNA in plant immunity. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(47): 18002?18007.

[23] Jones L, Hamilton AJ, Voinnet O, et al. RNA-DNA interactions and DNA methylation in post-transcriptional gene silencing. Plant Cell, 1999, 11(12): 2291?2301.

[24] Jones L, Ratcliff F, Baulcombe DC. RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Met1 for maintenance. Curr Biol, 2001, 11(10): 747?57.

[25] Mette MF, Aufsatz W, van der Winden J, et al. Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO J, 2000, 19(19): 5194?5201.

[26] Wassenegger M. RNA-directed DNA methylation. Plant Mol Biol, 2000, 43(2/3): 203?220.

[27] Huettel B, Kanno T, Daxinger L, et al. Endogenous targets of RNA-directed DNA methylation and Pol IV in Arabidopsis. EMBO J, 2006, 25(12): 2828?2836.

[28] Xie ZX, Johansen LK, Gustafson AM, et al. Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol, 2004, 2(5): e104.

[29] Pontes O, Li CF, Costa Nunes P, et al. The Arabidopsis chromatin-modifying nuclear siRNA pathway involves a nucleolar RNA processing center. Cell, 2006, 126(1): 79?92.

[30] Onodera Y, Haag JR, Ream T, et al. Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatin formation. Cell, 2005, 120(5): 613?622.

[31] Herr AJ, Jensen MB, Dalmay T, et al. RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA. Science, 2005, 308(5718): 118?120.

[32] Blevins T, Rajeswaran R, Shivaprasad PV, et al. Four plant Dicers mediate viral small RNA biogenesis and DNA virus induced silencing. Nucleic Acids Res, 2006, 34(21): 6233?6246.

[33] Chinnusamy V, Zhu JK. RNA-directed DNA methylation and demethylation in plants. Sci China C Life Sci, 2009, 52(4): 331?343.

[34] Haag JR, Pontes O, Pikaard CS. Metal A and metal B sites of nuclear RNA polymerases Pol IV and Pol V are required for siRNA-dependent DNA methylation and gene silencing. PLoS One, 2009, 4(1): e4110.

[35] Pikaard CS, Haag JR, Ream T, et al. Roles of RNA polymerase IV in gene silencing. Trends Plant Sci, 2008, 13(7): 390?397.

[36] Wierzbicki AT, Haag JR, Pikaard CS. Noncoding transcription by RNA polymerase Pol IVb/Pol V mediates transcriptional silencing of overlapping and adjacent genes. Cell, 2008, 135(4): 635?648. [37] Zheng BL, Wang ZM, Li SB, et al. Intergenic transcription by RNA polymerase II coordinates Pol IV and Pol V in siRNA-directed transcriptional gene silencing in Arabidopsis. Genes Dev, 2009, 23(24): 2850?2860.

[38] Kanno T, Bucher E, Daxinger L, et al. A structural-maintenance-of-chromosomes hinge domain-containing protein is required for RNA-directed DNA methylation. Nat Genet, 2008, 40(5): 670?675.

[39] Kanno T, Mette MF, Kreil DP, et al. Involvement of putative SNF2 chromatin remodeling protein DRD1 in RNA-directed DNA methylation. Curr Biol, 2004, 14(9): 801?805.

[40] Law JA, Ausin I, Johnson LM, et al. A protein complex required for polymerase V transcripts and RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis. Curr Biol, 2010, 20(10): 951?956.

[41] Cao XF, Jacobsen SE. Role of the Arabidopsis DRM methyltransferases in de novo DNA methylation and gene silencing. Curr Biol, 2002, 12(13): 1138?1144.

[42] Chan SWL, Henderson IR, Zhang XY, et al. RNAi, DRD1, and histone methylation actively target developmentally important non-CG DNA methylation in Arabidopsis. PLoS Genet, 2006, 2(6): e83.

[43] Havecker ER, Wallbridge LM, Hardcastle TJ, et al. The Arabidopsis RNA-directed DNA methylation argonautes functionally diverge based on their expression and interaction with target loci. Plant Cell, 2010, 22(2): 321?334.

[44] Matzke M, Kanno T, Daxinger L, et al. RNA-mediated chromatin-based silencing in plants. Curr Opin Cell Biol, 2009, 21(3): 367?376.

[45] Zilberman D, Cao XF, Jacobsen SE. ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science, 2003, 299(5607): 716?719.

[46] Gao ZH, Liu HL, Daxinger L, et al. An RNA polymerase II- and AGO4-associated protein acts in RNA-directed DNA methylation. Nature, 2010, 465(7294): 106?109.

[47] Dunoyer P, Brosnan CA, Schott G, et al. An endogenous, systemic RNAi pathway in plants. EMBO J, 2010, 29(10): 1699?1712.

[48] Okano Y, Miki D, Shimamoto K. Small interfering RNA (siRNA) targeting of endogenous promoters induces DNA methylation, but not necessarily gene silencing, in rice. Plant J, 2008, 53(1): 65?77.

[49] Heilersig BHJB, Loonen AEHM, Janssen EM, et al. Efficiency of transcriptional gene silencing of GBSSI in potato depends on the promoter region that is used in an inverted repeat. Mol Genet Genomics, 2006, 275(5): 437?449.

[50] Sijen T, Vijn I, Rebocho A, et al. Transcriptional and posttranscriptional gene silencing are mechanistically related. Curr Biol, 2001, 11(6): 436?440.

[51] Palauqui JC, Elmayan T, Pollien JM, et al. Systemic acquired silencing: transgene-specific post-transcriptional silencing is transmitted by grafting from silenced stocks to non-silenced scions. EMBO J, 1997, 16(15): 4738?4745.

[52] Voinnet O, Baulcombe DC. Systemic signalling in gene silencing. Nature, 1997, 389(6651): 553.

[53] Dunoyer P, Schott G, Himber C, et al. Small RNA duplexes function as mobile silencing signals between plant cells. Science, 2010, 328(5980): 912?916.

[54] Molnar A, Melnyk CW, Bassett A, et al. Small silencing RNAs in plants are mobile and direct epigenetic modification in recipient cells. Science, 2010, 328(5980): 872?875.

[55] Dunoyer P, Himber C, Ruiz-Ferrer V, et al. Intraand intercellular RNA interference in Arabidopsis thaliana requires components of the microRNA and heterochromatic silencing pathways. Nat Genet, 2007, 39(7): 848?856.

[56] Brosnan CA, Mitter N, Christie M, et al. Nuclear gene silencing directs reception of long-distance mRNA silencing in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(37): 14741?14746.

[57] Schwach F, Vaistij FE, Jones L, et al. An RNA-dependent RNA polymerase prevents meristem invasion by potato virus X and is required for the activity but not the production of a systemic silencing signal. Plant Physiol, 2005, 138(4): 1842?1852.

[58] Parizotto EA, Dunoyer P, Rahm N, et al. In vivo investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional relevance of the spatial distribution of a plant miRNA. Genes Dev, 2004, 18(18): 2237?2242.

[59] Vaistij FE, Jones L, Baulcombe DC. Spreading of RNA targeting and DNA methylation in RNA silencing requires transcription of the target gene and a putative RNA-dependent RNA polymerase. Plant Cell, 2002, 14(4): 857?867.

[60] Van Houdt H, Bleys A, Depicker A. RNA target sequences promote spreading of RNA silencing. Plant Physiol, 2003, 131(1): 245?253.

[61] Daxinger L, Kanno T, Bucher E, et al. A stepwise pathway for biogenesis of 24-nt secondary siRNAs and spreading of DNA methylation. EMBO J, 2009, 28(1): 48?57.

[62] Himber C, Dunoyer P, Moissiard G, et al. Transitivity-dependent and -independent cell-to-cell movement of RNA silencing. EMBO J, 2003, 22(17): 4523?4533.

[63] Kanazawa A, Inaba JI, Shimura H, et al. Virus-mediated efficient induction of epigenetic modifications of endogenous genes with phenotypic changes in plants. Plant J, 2011, 65(1): 156?168.

[64] Guo HS, Fei JF, Xie Q, et al. A chemical-regulated inducible RNAi system in plants. Plant J, 2003, 34(3): 383?392.

[65] Dong L, Liu M, Fang YY, et al. DRD1-Pol V-dependent self-silencing of an exogenous silencer restricts the non-cell autonomous silencing of an endogenous target gene. Plant J, 2011, 68(4): 633?645.

[66] Fischer U, Kuhlmann M, Pecinka A, et al. Local DNA features affect RNA-directed transcriptional gene silencing and DNA methylation. Plant J, 2008, 53(1): 1?10.

[67] Voinnet O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet, 2001, 17: 449?459.

[68] Ketting RF, Haverkamp THA, van Luenen HGAM, et al. Mut-7 of C. elegans, required for transposon silencing and RNA interference, is a homolog of Werner syndrome helicase and RNaseD. Cell, 1999, 99: 133?141.

[69] Wu-Scharf D, Jeong BR, Zhang CM, et al. Transgene and transposon silencing in Chlamydomonas reinhardtii by a DEAH-box RNA helicase. Science, 2000, 290(5494): 1159?1162.

[70] Grishok A, Pasquinelli AE, Conte D, et al. Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small temporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell, 2001, 106(1): 23?34.

[71] Ketting RF, Fischer SEJ, Bernstein E, et al. Dicer functions in RNA interference and in synthesis of small RNA involved in developmental timing in C. elegans. Genes Dev, 2001, 15(20): 2654?2659.