劉鈞天 摘譯 鄭捷 校

表達白細胞介素-23（IL-23）和白細胞介素-17A（IL-17A）的輔助性細胞（Th17細胞）軸在慢性炎癥性疾病的銀屑病發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。但IL-17等是否來源于Th17細胞尚不明確，其是否在銀屑病的炎癥浸潤和棘層肥厚皮損形成中起作用是本文研究的重點。

小鼠表皮中有大量樹突樣表皮T細胞（γδT細胞），同樣人類真皮中也存在γδT細胞。我們發(fā)現(xiàn)，IL-23刺激后，真皮中固有的γδT細胞大量產(chǎn)生IL-17。而表皮γδT細胞和真皮αβT細胞產(chǎn)生IL-17較少。研究表明IL-17分泌型γδT細胞在銀屑病患者的皮損中有大量浸潤。主要研究結(jié)果如下。

1 IL-23是皮膚中促進IL-17分泌的關鍵細胞因子

應用免疫熒光染色分析健康志愿者和銀屑病患者皮膚組織，確定IL-23的細胞來源。發(fā)現(xiàn)真皮的樹突狀細胞(DC)和巨噬細胞(Mφ)在銀屑病皮損中明顯增多。在咪喹莫特（IMQ）加重銀屑病鼠模型中，IL-23和IL-17的mRNAs轉(zhuǎn)錄明顯升高。說明DC和Mφ是分泌IL-23的主要細胞。

2 真皮γδT細胞是在IL-23刺激后分泌IL-17的主要細胞

分別制備小鼠真皮和表皮細胞單細胞懸液以檢測IL-17的細胞來源。表皮中的T細胞幾乎均為CD3和TCRγδ高表達的γδT細胞，在IL-23刺激下不產(chǎn)生任何IL-17；相反，真皮中的γδT細胞在IL-23刺激后分泌IL-17。又將皮膚中的CD3+TCRγδ+細胞分離出來，給予單純IL-23、IL-1β或聯(lián)合刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨給予IL-23或者IL-1β均不能刺激真皮γδT細胞產(chǎn)生IL-17，只有IL-23和IL-1β聯(lián)合刺激才可產(chǎn)生大量IL-17。使用IL-1β單抗處理或IL-1受體敲除鼠（IL-1R-/-）的皮膚細胞，進一步證實了在IL-23誘導的真皮γδT細胞分泌IL-17中需要IL-1β的協(xié)同參與。

3 真皮IL-17分泌型γδT細胞具有特定的表型和取用格式

為了解真皮γδT細胞是否具有特定的TCR取用片段，使用包括 Vγ1、Vγ4、Vγ5、Vγ6 和 Vγ7 等VγTCR特異性抗體檢測其取用格式。小部分真皮γδT細胞主要表達Vγ4，絕大部分表皮γδT細胞專一性表達Vγ5并有一部分與Vγ6抗體有交叉反應。約50% IL-17分泌型真皮γδT細胞表達Vγ4。給鼠注射Vγ4單抗，γδT細胞分泌IL-17的能力明顯降低。

趨化因子受體CCR6和轉(zhuǎn)錄因子RORγt與CD4+Th17細胞的分化及趨化作用有關。發(fā)現(xiàn)真皮γδT細胞組成性的表達CCR6和RORγt，而表皮γδT細胞卻沒有表達。

CD27被認為是區(qū)分干擾素γ（IFN-γ）分泌型γδT細胞及IL-17分泌型γδT細胞的關鍵細胞因子。表皮及真皮γδT細胞均是CD27-且不分泌IFN-γ。

4 IL-23和IMQ誘導的皮膚炎癥及棘層肥厚需要γδT細胞的參與

野生型鼠（WT鼠）皮內(nèi)注射IL-23可導致表皮增厚和大量中性粒細胞浸潤，在基因敲除TCRα-/-鼠表皮內(nèi)亦有大量浸潤，但在基因敲除TCRδ-/-鼠中浸潤明顯較輕。說明IL-23誘導的皮膚炎癥反應和棘層肥厚需要γδT細胞參與。

IMQ刺激皮膚后，真皮γδT細胞自發(fā)分泌大量IL-17。分別給 WT 鼠、TCR α-/-鼠和 TCRδ-/-鼠涂抹IMQ乳膏。其中WT鼠和TCR α-/-鼠在IMQ處理后出現(xiàn)表皮增厚和大量中性粒細胞浸潤，而TCRδ-/-鼠卻浸潤輕微。

5 IL-17受體在IL-23誘導的表皮增厚和皮膚炎癥中起重要作用

IL-17細胞因子家族包括6個成員，它們分別是IL-17A～F，通過IL-17受體（IL-17R）復合物參與炎癥反應。IL-17R在造血組織和銀屑病皮損中廣泛表達。與WT鼠模型相比，IL-23誘發(fā)IL-17RA-/-鼠的表皮增殖和中性粒細胞浸潤程度明顯減輕。Realtime PCR顯示W(wǎng)T鼠和IL-17RA-/-鼠在IL-23刺激后IL-17和IL-22 mRNA水平均明顯增高，TNF-α、MMP-9和 IFN-γ mRNAs沒 有 明 顯 改 變， 而 IL-6 mRNA水平在IL-17RA-/-小鼠中明顯降低。說明下游的IL-17R信號通路在IL-23誘導的表皮增厚等皮膚表現(xiàn)上起作用。

6 IL-23可以在體外刺激真皮γδT細胞的增生

單獨給予TLR2配體Pam3CSK和其他病原體并沒有刺激真皮γδT細胞增生，而IL-23單獨刺激卻顯著促進真皮γδT細胞增生。

通過胞內(nèi)染色發(fā)現(xiàn)TLR2配體Pam3CSK、TLR7配體Gardiquimod和TLR9配體CpG刺激真皮γδT細胞產(chǎn)生低水平的IL-17，而脂多糖（TLR4）和dectin-1的配體curdlan對真皮γδT細胞分泌IL-17無明顯作用。病原體產(chǎn)物聯(lián)合IL-23刺激皮膚細胞IL-17的平均熒光強度（MFI）明顯增強；ELISA同樣發(fā)現(xiàn)病原體產(chǎn)物和IL-23對IL-17分泌的協(xié)同效應。

7 在銀屑病患者皮損中有大量IL-17分泌型γδT細胞

在銀屑病皮損中CD3+T細胞明顯增多，真皮γδT細胞的比例和健康志愿者相比明顯增高。通過共聚焦顯微技術發(fā)現(xiàn)患者皮損真皮中有γδT細胞浸潤。健康對照組真皮γδT細胞即使給予IL-23刺激也只能產(chǎn)生極少的IL-17；而銀屑病皮損中有15% γδT細胞產(chǎn)生IL-17。

討 論

結(jié)果顯示，鼠模型中真皮γδT細胞是IL-17的主要來源。IL-23R可刺激產(chǎn)生皮膚炎癥和棘層肥厚。但在TCRδ-/-鼠和IL-17RA-/-鼠中，IL-23誘導和IMQ誘導的皮膚炎癥明顯較輕。

在銀屑病患者皮損和IMQ誘導的銀屑病鼠模型中均發(fā)現(xiàn)IL-23可以促進真皮γδT細胞分泌IL-17，同時，需要內(nèi)源性的IL-1β參與。

真皮γδT細胞的獨特之處在于：真皮γδT細胞均為CCR6+細胞，不表達CD27，不分泌IFN-γ，說明真皮γδT細胞是“專職”IL-17分泌細胞； IL-23可在體外刺激真皮γδT細胞增生，然而對脾臟γδT細胞的增生無影響。γδT細胞在銀屑病發(fā)病中的重要作用，敲除了該基因的鼠銀屑病模型皮膚炎癥反應明顯減輕。

與IL-23誘導的銀屑病鼠模型不同，IMQ誘導的銀屑病在TCR α-/-鼠中其表皮增厚也明顯減輕，顯示αβT和γδT細胞在IMQ誘導的皮膚炎癥反應中均有作用，但是IMQ誘導的中性粒細胞浸潤程度在TCRδ-/-鼠中明顯降低，而在TCR α-/-鼠沒有變化。此外，WT、TCR α-/-和 TCRδ-/-3種小鼠在 IMQ 刺激后其 IL-22的mRNA水平?jīng)]有明顯區(qū)別。以上這些結(jié)果說明IL-17、IL-22、γδT細胞和αβT細胞在IL-23或IMQ誘導的皮膚炎癥改變中對皮膚的組織病理改變不同。

本研究還發(fā)現(xiàn)了病原體對γδT細胞產(chǎn)生IL-17有刺激作用，支持了感染在銀屑病發(fā)病中起作用。TLR和dectin-1的配體在聯(lián)合IL-23刺激時促進了真皮γδT細胞分泌IL-17，這種協(xié)同作用同時需要IL-1R信號通路的參與。CD44hiCCR6+γδT細胞表達TLR1、TLR2和dectin-1，因此病原體產(chǎn)物可能直接刺激真皮γδT細胞分泌IL-17。

總之，銀屑病皮損真皮中γδT細胞的大量增生說明它們在慢性炎癥反應中也發(fā)揮決定作用。