張敏鴿綜述 劉明暉審校

據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心統(tǒng)計(jì)，宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率已位居第二位，且近年來有年輕化的趨勢(shì)。現(xiàn)有的研究顯示高危型HPV持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變，并進(jìn)一步引發(fā)宮頸癌的主要病因?，F(xiàn)將高危型HPV在宮頸癌中的致癌機(jī)制綜述如下。

1 HPV結(jié)構(gòu)與功能

HPV是1種嗜黏膜和皮膚的雙鏈閉合環(huán)狀DNA病毒，屬乳頭狀病毒科。HPV基因組按功能分為3個(gè)編碼區(qū)：①早期基因區(qū)(E區(qū))：分別編碼早期蛋白E1、E2、E4、E5、E6和E7。E區(qū)基因編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能主要涉及病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。E1參與病毒復(fù)制；E2參與病毒復(fù)制與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，高危型HPV的E2具有抑制E6、E7基因啟動(dòng)子的作用；E4主要與病毒顆粒的成熟和釋放有關(guān)，E4能破壞細(xì)胞骨架，打亂細(xì)胞質(zhì)角蛋白網(wǎng)絡(luò)，使挖空細(xì)胞形成。此外，E4可能支持病毒基因組的擴(kuò)增。E5能與多種細(xì)胞膜蛋白及生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，刺激病毒基因組復(fù)制。最近發(fā)現(xiàn)，E5還能阻止DNA損傷后細(xì)胞的凋亡。E6、E7主要與細(xì)胞轉(zhuǎn)化及致瘤性有關(guān)，其致瘤作用與細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制及腫瘤抑制基因密切相關(guān)。②晚期基因區(qū)(L區(qū))：L1和L2分別編碼病毒的主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白，共同構(gòu)成包裝病毒的外殼。③上游調(diào)節(jié)區(qū)：功能不明確，可能對(duì)病毒復(fù)制及轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用。

2 HPV在宮頸癌中的致癌機(jī)制

現(xiàn)已證實(shí)至少有18種高危型HPV能引發(fā)宮頸癌，研究表明，在85%～90%的宮頸腺癌中可檢測(cè)到高危型HPV，而HPV陰性者幾乎不發(fā)生宮頸癌。在高危型HPV中， HPV16 及18型是世界范圍內(nèi)宮頸癌感染的主要類型，感染率分別為50%和20%[1]，因而，絕大多數(shù)研究集中在HPV16及HPV18上。HPV16和HPV18可能通過以下機(jī)制參與宮頸癌的發(fā)生。

2.1 HPV E6/E7蛋白與宿主染色體整合

高危型HPV16 E6、E7已被證實(shí)為轉(zhuǎn)化基因，E7是效能最強(qiáng)的癌基因，其次是E6，且E6能增強(qiáng)E7轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞的能力，其編碼的E6、E7蛋白與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和病毒復(fù)制的調(diào)控有關(guān)，并在宮頸癌細(xì)胞系和組織內(nèi)持續(xù)表達(dá)，因此在宮頸癌細(xì)胞系中沉默這2種病毒基因可導(dǎo)致細(xì)胞快速死亡。HPV感染宿主細(xì)胞后低危型HPV-DNA總是保持游離狀態(tài)，很少整合到宿主基因組中，而大部分高危型HPV-DNA常整合到宿主細(xì)胞DNA中，在宮頸癌中高危HPV的E6和E7癌蛋白整合基因組的復(fù)制導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，E7蛋白還通過打斷G1/S檢查點(diǎn)，激活DNA損傷反應(yīng)，誘導(dǎo)中心體復(fù)制錯(cuò)誤導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞形成[2]，說明病毒基因整合到宿主基因后對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、永生化以及腫瘤的發(fā)生起重要作用。

2.2 HPV E2基因

在HPV整合過程中，許多基因被破壞或缺失，其中以E2基因的破壞尤為重要。E2能抑制E6和E7蛋白功能，當(dāng)HPV發(fā)生整合后，E2的開放讀碼框(ORF)常會(huì)遭到破壞，導(dǎo)致E2基因編碼的E2蛋白失活及功能喪失，接著引起E6、E7基因過表達(dá)，轉(zhuǎn)化能力增強(qiáng)， 導(dǎo)致細(xì)胞的轉(zhuǎn)化或癌變。另外，E2蛋白還能通過誘導(dǎo)凋亡途徑達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用[3]。故認(rèn)為在正常HPV病毒的生命周期中，E2蛋白主要是起抑制作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，正常人角蛋白細(xì)胞表達(dá)正義線粒體非編碼RNA (SncmtRNA-1)和反義線粒體非編碼RNA (ASncmtRNAs)，而宮頸癌細(xì)胞株SiHa 和 HeLa表達(dá)SncmtRNA-1及低水平的ASncmtRNAs，用完整基因組的HPV16和18感染的永生化的人角蛋白細(xì)胞也表達(dá)SncmtRNA-1及低水平的ASncmtRNAs。相對(duì)于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞或用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞，用反義寡核苷酸(ASO-1AS)敲除SiHa 和 HeLa中的SncmtRNA-1，細(xì)胞增殖及DNA合成明顯受抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的ASncmtRNAs是細(xì)胞瘤性轉(zhuǎn)化以及腫瘤進(jìn)展中關(guān)鍵的一步，推測(cè)ASncmtRNAs在腫瘤細(xì)胞中的低表達(dá)提示其作為線粒體編碼的腫瘤抑制因子的潛在可能性。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HPV16和18的E2基因在瘤性轉(zhuǎn)化以及腫瘤進(jìn)展中參與了ASncmtRNAs的降調(diào)節(jié)[4]。

2.3 HPV E5基因

E5的功能是促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這種功能發(fā)生在宮頸癌的早期。在宮頸癌細(xì)胞系C-33A，HPV16 E5的表達(dá)能抑制過氧化氫介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，HPV16 E5降解Bax蛋白的表達(dá)，Bax的外源性表達(dá)消除了E5的抗凋亡作用，通過siRNA敲除E5則激活宮頸癌細(xì)胞系CaSki通過過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)也上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，短暫表達(dá)的E5通過泛素化作用明顯增加Bax蛋白的降解，環(huán)氧化酶2抑制劑、前列腺素E2受體拮抗劑和環(huán)磷酸腺苷依賴的PKA抑制劑能抑制E5介導(dǎo)的Bax蛋白降調(diào)節(jié)。用前列腺素E2能下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)并抑制過氧化氫誘導(dǎo)的C-33A細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步證實(shí)HPV16 E5蛋白是通過激發(fā)泛素蛋白酶介導(dǎo)的Bax蛋白的降解來抑制過氧化氫誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡，COX-2，PGE2和PKA也參與此過程[5]。說明HPV16E5蛋白通過抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。

2.4 抑制腫瘤抑制基因p53及Rb

HPV16 E6蛋白能降解多種細(xì)胞蛋白，包括腫瘤抑制基因p53和多個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白，研究表明來自于高危型HPV16、18、33、35、39、45、51、52、53、56、58、66、70、82的E6蛋白均能降解p53，體外研究發(fā)現(xiàn)這些E6蛋白降解p53的效能是相似的，相反，表達(dá)低危型HPV6、11、44、54和61的E6蛋白的角蛋白細(xì)胞不發(fā)生p53降解。當(dāng)發(fā)生單點(diǎn)變異后的E6F47R則能完全逆轉(zhuǎn)HPV16 E6癌蛋白的作用，在HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系，E6F47R作為1個(gè)顯性負(fù)性突變體通過阻止內(nèi)源性E6降解p53而提高p53蛋白水平。然而，E6F47R的持續(xù)表達(dá)通過早衰抑制宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞的增殖，針對(duì)p53的siRNA能抵消E6F47R的表達(dá)效果[6]。這表明E6F47R是主要通過p53信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。

E6、E7基因編碼蛋白能分別與抑癌基因p53(針對(duì)E6)和Rb蛋白(針對(duì)E7)結(jié)合，同時(shí)抑制p27、p21及p15等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，使大量細(xì)胞由細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期，使其失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的正常調(diào)控而引起細(xì)胞無限增殖并向惡性轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPVE6蛋白與野生型p53結(jié)合誘導(dǎo)p53快速降解此過程依賴1種細(xì)胞蛋白E6相關(guān)蛋白(E6-AP)。E6蛋白通過與E6-AP形成復(fù)合物可起到泛肽-蛋白激酶的作用降解和失活p53，最近發(fā)現(xiàn)HPV16和HPV18的E6蛋白也與其他的泛素連接酶相互作用，在無E6AP蛋白的小鼠上皮細(xì)胞中E6加速p53的降解，這意味著其它的遍在蛋白連接酶參與了HPV介導(dǎo)的p53降解[7]，沉默E6蛋白導(dǎo)致p53和p21的增多，相反，沉默E7蛋白導(dǎo)致Rb蛋白的過度磷酸化，相對(duì)于HPV陰性的細(xì)胞，缺失E6和E7蛋白的HPV陽性細(xì)胞則選擇性減少細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞大量死亡。HPV16-E7 shRNA通過激活p53、p21和Rb能顯著促進(jìn)HPV16相關(guān)的癌細(xì)胞的凋亡[8]。抑制HPV E6、E7癌蛋白則腫瘤抑制基因復(fù)活、腫瘤細(xì)胞凋亡。Withaferin A (WA)是藥用植物Withania Somnifera的有效成分，它能降調(diào)節(jié)HPVE6和E7癌蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致p53和p21cip1/waf1水平升高及宮頸癌細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期停滯于G2/M期，降低STAT3和它的Tyr705 和Ser727磷酸化水平，以及調(diào)節(jié)p53介導(dǎo)的凋亡基因Bcl-2，Bax，caspase-3和裂解的 PARP[9]。Tan用小干擾RNA (siRNA)抑制E6后使p53表達(dá)水平恢復(fù)，使HPV16+的宮頸癌細(xì)胞株SiHa對(duì)順鉑、放射敏感而凋亡，E6 siRNA 導(dǎo)致E6 mRNA水平降低并且提高了p53和p21表達(dá)[10]。

在1個(gè)正常角蛋白細(xì)胞中，Rb-組蛋白脫乙?；?HDAC)蛋白復(fù)合體抑制E2F/DP-1轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的活性，在G1期，E2F-DP1與DNA結(jié)合，在S期，Rb被細(xì)胞周期蛋白D/CDK4/6激酶磷酸化，導(dǎo)致Rb-HDAC 從 E2F-DP1-DNA復(fù)合體釋放出來。從E2F-DP1-DNA釋放出來的 Rb-HDAC導(dǎo)致E2F誘導(dǎo)的參與DNA合成的基因激活，在1個(gè)高危HPV感染的角蛋白細(xì)胞中，E7蛋白通過磷酸化Rb和(或)HDAC(組蛋白脫乙?；?蛋白，導(dǎo)致Rb-HDAC 從 E2F-DP1-DNA復(fù)合體脫離出來，導(dǎo)致E2F啟動(dòng)子的激活以及細(xì)胞周期的進(jìn)展[11]。

2.5 p16INK4A的過表達(dá)

在HPV感染宮頸上皮細(xì)胞中，p16INK4A在宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及宮頸癌中過表達(dá)，Missaoui等通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)正常宮頸及宮頸良性病變中不表達(dá)p16INK4A，在CINⅠ弱表達(dá)，而在CINⅡ、CINⅢ以及宮頸鱗狀細(xì)胞癌強(qiáng)表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)p16INK4A過表達(dá)與宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變的級(jí)別以及高危HPV感染有關(guān)[12]，Tsoumpou等通過Meta分析發(fā)現(xiàn)宮頸涂片中過表達(dá)p16INK4A的程度與細(xì)胞學(xué)異常的嚴(yán)重性是一致的。相對(duì)于LSIL 45%和HSIL 89%的p16INK4A陽性表達(dá)率，正常涂片的p16INK4A陽性表達(dá)率僅12%，正?；罱M織檢查p16INK4A的陽性率僅為2%，CINⅠ為38%，CINⅡ68%和CINⅢ為82%[13]。CARMEN發(fā)現(xiàn)在宮頸細(xì)胞學(xué)中，ASC-US中 p16INK4A陽性表達(dá)為16.66%，LSILs為40.62%，HSILs為96.29%，SCCs為100%[14]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)p16通過鈍化細(xì)胞周期蛋白依賴激酶作用在細(xì)胞周期中安置制動(dòng)蛋白依賴激酶能磷酸化Rb蛋白，在宮頸癌中，通過HPV E7降解PRb的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制導(dǎo)致p16的上調(diào)，p16INK4A抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK-4或-6與細(xì)胞周期蛋白D結(jié)合，這是調(diào)節(jié)G1細(xì)胞周期關(guān)卡[15]。

2.6 激活端粒酶

端粒酶是使端粒延伸的反轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶，正常情況下不表達(dá)，但在85%以上的腫瘤細(xì)胞中呈陽性表達(dá)。因而目前將端粒酶作為腫瘤發(fā)生的分子標(biāo)記之一。端粒酶的激活是高危型HPV感染宮頸上皮后由CIN向癌轉(zhuǎn)化的過程中相當(dāng)關(guān)鍵的步驟。Bedard等[16]報(bào)道HPVE6/E7的轉(zhuǎn)錄基因可以誘導(dǎo)端粒酶的活性和永生化，發(fā)現(xiàn)在宮頸癌和CIN的鱗狀上皮損害早期就有改變，但也在低分化鱗狀上皮損害時(shí)表達(dá)。通過sh/siRNAs沉默E6AP基因，端粒酶的活性降低，證實(shí)E6AP參與了E6介導(dǎo)的端粒酶激活。羅瓊等[17]發(fā)現(xiàn)端粒酶活性隨著宮頸病變程度的進(jìn)展逐漸增高。Xu等[18]發(fā)現(xiàn)在90%以上的宮頸癌及近一半的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)，而在大多數(shù)正常宮頸組織以及低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變中沒有檢測(cè)到hTERT mRNA和端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性。這說明端粒酶的活性增加與宮頸癌發(fā)生的早期階段有關(guān)。

在上皮細(xì)胞，NFX1作為2個(gè)剪接變體表達(dá)。NFX1的2個(gè)亞型都參與hTERT的調(diào)控。較短的亞型NFX1-91，是核內(nèi)蛋白。在hTERT啟動(dòng)子部位，NFX1-91通過直接干擾mSin3A 和HDACs(組蛋白脫乙?；?保持轉(zhuǎn)錄不活動(dòng)狀態(tài)來抑制hTERT的表達(dá)。在HPV16 E6存在下，E6AP只能作用于較短的亞型NFX1-91，E6與E6AP能降解hTERT抑制物NFX1-91，通過降解NFX1-91，E6/E6AP改變了hTERT啟動(dòng)子的染色體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致hTERT的表達(dá)增加。較長(zhǎng)的亞型，NFX1-123，存在于蛋白質(zhì)，在細(xì)胞核內(nèi)不存在，它與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的多聚腺甘酸結(jié)合蛋白質(zhì)類 (PABPCs)一致地通過增加hTERT mRNA的穩(wěn)定性來上調(diào)hTERT的表達(dá)。

2.7 其它致癌機(jī)制

HPV16 E6蛋白通過NF-kB途徑上調(diào)抑制細(xì)胞凋亡的蛋白如：c-IAP2和survivin。c-IAP2是NF-kB應(yīng)答基因，經(jīng)常作為NF-kB上調(diào)的指示劑，降低NFX1-91，則上調(diào)c-IAP2。E6/E6AP通過誘導(dǎo)NFX1-91的降解來正調(diào)節(jié)NFkB信號(hào)途徑，這包括NFkB應(yīng)答基因的升調(diào)節(jié)以及NFkB抑制基因的降調(diào)節(jié)。E6還能防止腫瘤壞死因子TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。P105，是p50的前體，是NFkB的抑制劑。p105在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，它的啟動(dòng)子區(qū)包含有NFkB和其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，如E2F、Sp1和 Ets。NFX1-91通過結(jié)合到p105的啟動(dòng)子區(qū)并且升調(diào)節(jié)它的轉(zhuǎn)錄活性來調(diào)控p105的表達(dá)，E6/E6AP通過誘導(dǎo)NFX1-91的降解降低p105和它分解產(chǎn)物p50的表達(dá)，p50，如p65/c-Rel缺乏，可能影響NFkB異二聚體的結(jié)構(gòu)，這種NFkB復(fù)合物抑制HPV基因表達(dá)。E6利用多種機(jī)制調(diào)節(jié)NFkB的活性，在缺氧環(huán)境下，E6能誘導(dǎo)NFkB抑制劑CYLD的降解去激活NFkB途徑，但在含氧正常的情況下，這種現(xiàn)象看不到。表明E6不同條件下利用不同機(jī)制調(diào)控NFkB的活性[19]。

HPV16 E6癌蛋白抑制角蛋白細(xì)胞表面黏附分子E-cadherin。降低HPV感染的角蛋白細(xì)胞表面的E-cadherin的表達(dá)則在感染上皮中的抗原提呈細(xì)胞郎罕氏細(xì)胞數(shù)量也會(huì)減少，因?yàn)槔珊笔霞?xì)胞通過E-鈣黏蛋白發(fā)生黏附，潛在降低了對(duì)HPV的免疫監(jiān)視作用。AzaDC (1個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)和 I3C通過1個(gè)p21(Waf1/Cip1)依賴機(jī)制對(duì)抗E6提高E-cadherin表達(dá)，從而恢復(fù)了HPV感染表皮中的抗原提呈細(xì)胞，因此它能對(duì)抗HPV16誘導(dǎo)的免疫逃避機(jī)制以恢復(fù)感染部位的免疫功能。

最近研究表明，HPV16 E6和E7通過傳感器toll-like 受體 (TLRs)家族來調(diào)控先天性免疫應(yīng)答。這些癌蛋白通過不同的機(jī)制抑制TLR9的表達(dá)，經(jīng)證實(shí)它能識(shí)別dsDNA序列，而低危型HPV不具有這種特性。高危型HPV還有一些特性，如非裂解性復(fù)制，在免疫組織低蛋白表達(dá)，在頂端釋放病毒顆粒，這些能減少或防止它們暴露于宿主的防御功能之下[20]。

綜上所述，在宮頸癌發(fā)生過程中，感染高危HPV后不僅導(dǎo)致抑癌基因、癌基因改變、染色體非整倍性變異、基因缺失或突變以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化等分子遺傳學(xué)的改變，還在逃避宿主免疫應(yīng)答中具有重要作用，這些功能是高危型HPV介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的基本機(jī)制。

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