羅莉，李坤，王保成，王明蓉

·綜述·

包涵體變復性技術研究進展

羅莉，李坤，王保成，王明蓉

現(xiàn)代生物技術的迅猛發(fā)展使大規(guī)模表達異源重組蛋白成為現(xiàn)實，這極大地促進了蛋白類產(chǎn)品的開發(fā)，尤其是重組蛋白藥物的研發(fā)。目前非糖基化的重組蛋白表達多采用大腸桿菌的原核表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)的突出特點是表達產(chǎn)物多以包涵體形式存在。與蛋白可溶性表達相比，包涵體具有產(chǎn)量高、蛋白穩(wěn)定、容易純化等優(yōu)點，對毒性蛋白制備尤其適宜。因此，采用包涵體形式已成為規(guī)模制備重組蛋白產(chǎn)品的主要途徑之一。

包涵體形成的原因普遍認為主要是外源蛋白在細胞內(nèi)的高表達使蛋白合成速度過快，沒有時間形成正確折疊；另外原核表達系統(tǒng)由于缺乏蛋白翻譯后修飾，也容易形成包涵體；培養(yǎng)條件如溫度、pH 值、培養(yǎng)基成分等也是影響包涵體形成的因素。由于包涵體絕大多數(shù)是不溶的，沒有生物活性的，因而需要經(jīng)過蛋白質變性-復性的過程以恢復其生物活性。目前重組蛋白變復性過程中的技術難點主要在提高蛋白濃度和生物活性兩方面，而尋找高效、快速、低成本的變復性方法是該領域研究的重點。隨著重組蛋白產(chǎn)品研發(fā)的異軍突起，包涵體變復性技術的研究再次成為了國內(nèi)外關注的焦點。

1 包涵體的變性

包涵體因具有高密度（1.3 mg/ml）和高抗剪切力，在變性前常采用高壓勻漿或超聲的方法破碎細菌，然后再洗滌除去破碎后樣品中含有的脂類、雜蛋白、核酸、脂多糖等雜質。經(jīng)過洗滌的包涵體，需要進一步加入變性溶液，以破壞維持包涵體蛋白結構的分子內(nèi)和分子間作用力，從而使多肽鏈伸展達到溶解包涵體的作用。

1.1 變性溶液的改進

一般常用的變性溶液中含有去垢劑或離液劑。常用的去垢劑如 SDS、十二烷基肌氨酸等，可破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，溶解包涵體。常用的離液劑如 6 ～ 8 mol/L 的尿素或鹽酸胍，可破壞蛋白間的氫鍵，使蛋白增溶。強變性劑或變性劑濃度過高可能造成蛋白的不可逆失活，因此采用降低變性劑濃度的溫和變性條件，甚至非變性的條件去溶解包涵體成為了該研究的新方向。Tsuji 等[1]報道，在 3.5 mol/L 鹽酸胍變性液中加入 8 mmol/L 半胱氨酸可有效溶解包涵體且對其后續(xù)的蛋白復性有極大的促進作用。但如果在復性前透析除去半胱氨酸則該變性蛋白復性率又降回到變性液中沒有半胱氨酸存在時的復性率。同樣，如果將半胱氨酸只加入到復性液中也不能提高復性效率。這為含二硫鍵蛋白變性條件的優(yōu)化提供了一個新思路。最近 Li 等[2]比較了 7 mol/L鹽酸胍、8 mol/L 尿素、2％ Sarkosyl 與 2 mol/L 尿素加高pH 值（通常為 12.5，過高可能引起蛋白降解）的變性液對rhG-CSF 包涵體蛋白的溶解和復性的影響，認為高 pH 環(huán)境能有效溶解該蛋白，低濃度的尿素具有協(xié)同作用，并且2 mol/L 尿素加高 pH 值的條件沒有破壞蛋白二級結構，又能有效減少聚集體的形成，因而更有利于蛋白的復性。另外，Singh 等[3]研究了含有不同羥基的醇類，如甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、丙三醇、丁醇對 hGH 包涵體蛋白的溶解，認為 6 mol/L 正丙醇加 2 mol/L 尿素的溶解效果最好。雖然此條件溶解的蛋白量比用尿素、鹽酸胍強變性劑溶解的蛋白量少，但此法溶解的蛋白復性率較后兩者高，推測可能與該包涵體蛋白在這種非變性條件下仍保有類天然態(tài)的二級結構有關。

1.2 變性方法的改進

包涵體蛋白的溶解通常采用一步變性法，即用含有高濃度的鹽酸胍或尿素的變性溶液一次變性。2005 年，Wang 等[4]采用兩步變性法對 hIL-2/GM-CSF 包涵體蛋白進行變復性研究。首先用 7 mol/L 鹽酸胍進行第一次變性（也可用含 L-精氨酸的堿性溶液代替鹽酸胍進行第一次變性[5]），變性后包涵體中錯誤折疊的蛋白被完全展開，然后用 10 mmol/L HCl 透析除去變性液，蛋白重新聚集，再用8 mol/L 尿素溶解，這樣得到的蛋白溶液在之后的復性過程中更有可能形成正確結構。而且經(jīng)歷了一次變性析出過程后，目的蛋白的純度更高，有利于提高復性效率。2011 年Yang 等[5]對這種兩步變性一步復性方法（two-step-denaturing and refolding method，2DR）在蛋白變復性中的應用進行了深入研究。首先采用該方法對 3 種不同折疊特性的蛋白（EGFP、MMP12、NRSF/REST DBD）變復性后的生物活性進行檢測，表明 2DR 法比傳統(tǒng)的一步變性一步復性方法更有效；接著對 88 種包涵體蛋白采用 2DR 方法進行變復性研究，其中 76％ 的蛋白平均復性率高于 75％（圖 1），表明此方法可廣泛應用于包涵體蛋白的變復性研究和工業(yè)應用。

2 包涵體的復性

變性后的蛋白不具有生物活性，因此需要進行蛋白的重折疊，以恢復其正確空間結構，從而獲得生物活性。

圖1 88種包涵體蛋白 2DR 復性率

2.1 復性方法的研究進展

稀釋復性法和透析復性法是兩種經(jīng)典的蛋白復性方法，主要是通過降低變性劑濃度，使蛋白緩慢重折疊，從而實現(xiàn)復性。這兩種方法需要的稀釋液或透析液體積較大，且復性時間長，因此在工業(yè)應用上有一定的限制。

近幾年發(fā)展起來一種高流體靜壓復性（HHP）方法，其基本原理是利用 0.25 ～ 3.5 kbar （1 bar = 100 000 Pa）高壓（1.5 ～ 3.0 kbar 更優(yōu)）[6]使變性蛋白壓縮到最緊致的狀態(tài)（最少的疏水區(qū)暴露，最大的分子內(nèi)靜電作用），當壓力消失的時候，就朝向最穩(wěn)定的構象伸展，實現(xiàn)變性蛋白的復性。此方法已成功用于重組人 DNA 多聚酶 v[7]、OmpA70[8]等包涵體蛋白的復性。

此外，近年來發(fā)展最為迅速的復性方法是蛋白質折疊液相色譜（PFLC）[9]，主要包括尺寸排阻色譜（SEC）、親和色譜（AFC）、離子交換色譜（IEC）和疏水相互作用色譜（HIC）。SEC 是利用變性蛋白隨著流動相進入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙時，由于變性劑濃度降低促使蛋白重折疊，其分子Stokes 半徑逐漸減少，當?shù)鞍淄耆珡托詴r，Stokes 就是一個常數(shù)，蛋白以天然狀態(tài)被洗脫下來，此法對蛋白生物活性影響較小。AFC 是利用色譜柱上特異配體與目的蛋白間可逆的親和作用使變性蛋白保留在柱上，與變性劑分離，而后在洗脫過程中進行復性。它具有高選擇性、高分辨率和高容量的特點。近年來固定化金屬親和色譜（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）是這類技術中應用最為廣泛的。IEC 是利用變性蛋白與固定相分子間電荷作用而被吸附到固定相表面，在洗脫過程中進行吸附-解吸附-再吸附的復性。HIC 作用基礎是溶質在高濃度鹽中保留，低濃度鹽中洗脫的色譜模式，疏水作用有效抑制變性蛋白的相互聚集，有利于蛋白的折疊。目前 PFLC 因為具有有效移除變性劑，同時進行目的蛋白的復性和純化，以及變性劑易回收的優(yōu)點，被廣泛應用于重組蛋白的復性研究。

2.2 復性效率提高的改進

變性蛋白在復性過程中遇到的主要困難有復性濃度低、復性過程中容易重新形成聚集體，以及復性蛋白的生物活性低等問題。因此人們在研究蛋白變復性技術時針對這3方面的問題提出了不少的改進方法和建議。

2.2.1提高復性濃度 蛋白濃度是影響復性效率的一個主要因素，由于蛋白在高濃度條件下容易形成聚集或錯誤折疊，因此一般采用低濃度（＜ 0.1 mg/ml）復性，但這又會延長工藝流程，降低生產(chǎn)效率，不適合大規(guī)模生產(chǎn)。多次、間斷的脈沖式方法與各種復性技術結合，可以顯著提高復性濃度，如 Chen 和 Leong[10]采用脈沖式 SEC（pulsed fed SEC，PF-SEC），通過 3 次上樣，使 AFP（α-胎球蛋白）的上樣量從 5 mg 提高到 17.7 mg，復性濃度達到 0.9 mg/ml，而復性收率只從 60％ 輕微下降到 53％。此外他們還比較了PF-SEC 和脈沖式稀釋復性 2 種方法，結果表明前者復性收率及純度（53％ 和 40％）都顯著高于后者（7％ 和5％）。

2.2.2減少聚集體形成 在復性過程中除去變性劑或降低其濃度后蛋白容易重新聚集，尤其是在蛋白濃度提高后更為明顯，這對復性過程非常不利。目前防止蛋白聚集體產(chǎn)生的措施有：①在稀釋和透析復性中可通過添加一些小分子物質來減少聚集體形成，主要有兩類：一類目的是增加蛋白穩(wěn)定性，如 MgCl2、甘氨酸、硫酸銨、多元醇、低濃度尿素或鹽酸胍等；一類目的是減少聚集體形成，如精氨酸、脯氨酸、聚乙二醇等[11]。②PFLC 復性過程中，蛋白的聚集可能會引起柱壓升高、堵柱等問題。人工分子伴侶可幫助蛋白折疊和減少聚集，目前已與 PFLC 法結合，廣泛應用于蛋白復性。樣品進入 SEC 柱前先經(jīng)過分子伴侶，可以改善上樣過程和柱上復性時易出現(xiàn)的變性蛋白聚集的情況，但進樣時間和體積非常重要[12]。在 IMAC 基礎上引入人工分子伴侶（artificial chaperone-assisted IMAC，AC-IMAC），常用的是CTAB-βCD（cetyltrimethylammonium bromide-β-cyclodextrin）體系。首先將蛋白和 CTAB 混合形成復合物，再通過 His標簽結合到 IMAC 柱上，然后用含有 βCD 的復性液移除CTAB，從而實現(xiàn)蛋白的柱上復性。Dong 等[13]報道利用此法獲得了純度達 99％，活性達 80％ 的 EGFP 重組蛋白，比稀釋復性（活性 14％）、分子伴侶輔助復性（活性 26％）、IMAC 復性（活性 60％）的效率都高；2010 年，Wang 等[14]在對 lysozyme 重組蛋白的復性中采用人工分子伴侶與 IEC 結合的方法，即 AMC-IEC（artificial molecular chaperone-IEC），表明蛋白起始濃度在 200 mg/ml 時，CTAB也可有效抑制蛋白聚集，并且蛋白濃度為 180 mg/ml 時的AMC-IEC 復性效率（76.6％）比單獨的 IEC 復性效率（42.4％）高的多。③其他方法。Yamamoto 等[15]認為在復性液中加入去污劑和水溶性有機溶劑對蛋白復性有很好的協(xié)同作用，一方面去污劑阻止蛋白聚集，另一方面有機溶劑可以影響蛋白-蛋白、蛋白-去污劑之間的相互作用。他們通過對溶菌酶復性條件的研究，表明復性液中加入 2 mmol/L 的 CTAB 和 20％ 的 DMSO 的復性效率（34％）比不加CTAB 和 DMSO 的復性效率（10％）和只加 CTAB（13％）或 DMSO（20％）的復性效率都高。

2.2.3提高蛋白生物活性 復性最終的目的是要獲得有生物活性的蛋白，所以復性蛋白量的提高并不意味著有活性蛋白的含量就提高了。在復性過程中蛋白所處環(huán)境的改變是影響其生物活性的重要因素，因而緩慢改變復性環(huán)境（尤其是變性劑的濃度）將有利于蛋白生物活性的提高。具體方法有如下兩種：①一元梯度。緩慢降低變性劑濃度能為蛋白重折疊提供一個較溫和的條件，有利于提高蛋白生物活性。這種技術與 SEC 結合已在 rhG-CSF[16]復性中獲得成功，但這種方法中變性劑的最終濃度和變性劑改變的梯度長度與蛋白復性效率息息相關[17]。②二元梯度。在一元梯度的基礎上又提出了二元梯度的復性方式，它主要是通過緩慢降低變性劑濃度的同時逐漸增加幫助折疊的添加劑的濃度，使復性效率進一步得到提高。如 pH-尿素二元梯度（DT389-hIL13重組蛋白[18]，pH 3.0 → 8.0，尿素 8 → 0.5 mol/L）、精氨酸-尿素二元梯度（NTA 重組蛋白[19]，精氨酸 0 → 0.6 mol/L，尿素 8 → 2 mol/L）、甘油-鹽酸胍二元梯度（rhG-CSF[20]，甘油0 → 15％，鹽酸胍 6 → 0 mol/L）等。

2.3 復性條件優(yōu)化的新方法

蛋白復性是一個十分復雜的過程，影響復性的因素也有很多，比如蛋白濃度、離子強度、溫度、溶液 pH 值、添加劑的濃度和組合等，這無疑增加了研究人員的工作量，因此高通量篩選技術在這種情況下迅速發(fā)展起來。Nara 等[21]報道了使用沸石（zeolite）的高通量蛋白復性篩選方法，沸石是一種多孔的晶狀鋁硅酸鹽，不同的 SiO2/Al2O3比例表現(xiàn)了不同的離子交換特性和疏水性。首先用 6 mol/L 鹽酸胍溶解包涵體，然后吸附到 96 孔板的沸石上，分別加入含有不同 pH值、鹽濃度、添加劑等的復性溶液，從而篩選出最適的復性條件。它最大的優(yōu)點是在高濃度鹽存在的情況下，蛋白也可以被很好地吸附。Dechavanne 等[22]提出將高通量復性篩選和實驗設計（design of experiments，DOE）軟件相結合的兩步復性條件篩選。首先在 96 孔板上進行96 種不同條件的復性，以確定影響該蛋白復性的因素，接著用 DOE 軟件設計第二次復性篩選方案，每個因素都有較廣的濃度范圍，從而確定各種添加物的最優(yōu)濃度，此法需要的蛋白量低（只需要 40 mg 變性蛋白）、耗時短（少于2 周）。

3 展望

要獲得以原核系統(tǒng)表達的活性重組蛋白可以從以下幾個方向考慮：①從上游基因構建（如同義密碼庫、融合蛋白構建）、蛋白表達（培養(yǎng)基、溫度等條件優(yōu)化）出發(fā)，盡可能使重組蛋白以可溶的活性形式存在，減少包涵體形成。②包涵體變復性技術路線。此法難點在于如何將無生物活性、錯誤折疊的不溶蛋白轉變成有活性的可溶蛋白。由于變性過程中強變性劑易導致蛋白不可逆失活，因而人們越來越關注尋找溫和、甚至非變性的條件來代替強變性條件，并且在變性方法上也在尋求新的突破。蛋白變性后的復性方法有很多種，但由于每種蛋白都有自己特有的折疊方式和途徑，因而至今沒有一種對所有包涵體蛋白都通用的復性方法。PFLC法具有復性和純化同步進行的顯著優(yōu)點，因而發(fā)展最為迅速。另外在復性過程中提高蛋白濃度和生物活性是復性技術的瓶頸，因此近年來人們在這方面做了很多研究，并取得了一定的進展。③過去認為包涵體是無活性、錯誤折疊的蛋白，但 2005 年，García-Fruitós 等[23]提出不是所有包涵體都是無生物活性的。同年，Jevsevar 等[24]也報道他們從包涵體中不通過變性-復性過程就提取出了有活性的 hG-CSF蛋白，后來人們陸續(xù)證實了這種非傳統(tǒng)包涵體[25-26]的存在。2012 年，Sans 等[27]報道通過優(yōu)化表達 FucA 醛縮酶的培養(yǎng)條件獲得了具有生物活性的包涵體，并且其生物活性比用傳統(tǒng)培養(yǎng)條件獲得的可溶性蛋白的生物活性更高。無疑這種非傳統(tǒng)包涵體的提出給原核系統(tǒng)表達重組蛋白帶來了新的曙光，但由于其形成機制以及獲得條件和途徑都不清楚，因而還處在研究的初級階段，但其潛力巨大，不容忽視。

[1] Tsuji I, Mastui H, Ito T, et al. L-cysteine-enhanced renaturation of bioactive soluble tumor necrosis factor ligand family member LIGHT from inclusion bodies in Escherichia coli. Protein Expres Purif, 2011, 80(2):239-245.

[2] Li M, Fan H, Liu J, et al. High pH solubilization and chromatography-based renaturation and purification of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor from inclusion bodies. Appl Biochem Biotech, 2012, 166(5):1264-1274.

[3] Singh SM, Sharma A, Upadhyay AK, et al. Solubilization of inclusion body proteins using n-propanol and its refolding into bioactive form. Protein Expres Purif, 2012, 81(1):75-82.

[4] Wang QR, Ma L, Zhou MQ, et al. Expression, refolding, purification, and bioactivity of recombinant bifunctional protein, hIL-2/GM-CSF. Protein Expres Purif, 2005, 39(2):131-136.

[5] Yang Z, Zhang L, Zhang Y, et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-stepdenaturing and refolding method. PLoS One, 2011, 6(7):e22981.

[6] Randolph TW, Carpenter JF, John RS. High pressure refolding of protein aggregates and inclusion bodies: US, 2010/0255536 A1. 2010-10-07.

[7] Arana ME, Powell GK, Edwards LL, et al. Refolding active human DNA polymerase v from inclusion bodies. Protein Expres Purif, 2010, 70(2):163-171.

[8] Fraga TR, Chura-Chambi RM, Goncales AP, et al. Refolding of the recombinant protein OmpA70 from Leptospira interrogans from inclusion bodies using high hydrostatic pressure and partial characterization of its immunological properties. J Biotechnol, 2010, 148(2-3):156-162.

[9] Geng X, Wang C. Protein folding liquid chromatography and its recent developments. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007, 849(1):69-80.

[10] Chen Y, Leong SSJ. High productivity refolding of an inclusion body protein using pulsed-fed size exclusion chromatography. Process Biochem, 2010, 45(9):1570-1576.

[11] Gerami SMN, Farajnia S, Mahboudi F. Co-solute assistance in refolding of recombinant proteins. Afr J Biotechnol, 2011, 10(53): 10811-10816.

[12] Chen YC, Liu HS. Chaperon solvent plug design in size-exclusion chromatography protein refolding process. Enzyme Microb Tech, 2011, 49(2):203-208.

[13] Dong XY, Chen LJ, Sun Y. Refolding and purification ofhistidine-tagged protein by artificial chaperone-assisted metal affinity chromatography. J Chromatogr A, 2009, 1216(27):5207-5213.

[14] Wang C, Zhang Q, Cheng Y, et al. Refolding of denature/reduced lysozyme at high concentrations by artificial molecular chaperone-ion exchange chromatography. Biotechnol Prog, 2010, 26(4):1073-1079.

[15] Yamamoto E, Yamaguchi S, Nagamune T. Synergistic effects of detergents and organic solvents on protein refolding: control of aggregation and folding rates. J Biosci Bioeng, 2011, 111(1):10-15.

[16] Wang C, Wang L, Geng X. High recovery refolding of rhG-CSF from Escherichia coli, using urea gradient size exclusion chromatography. Biotechnol Prog, 2008, 24(1):209-213.

[17] Wang C, Cheng Y. Urea-gradient protein refolding in size exclusion chromatography. Curr Pharm Biotechno, 2010, 11(3):289-292.

[18] Sun W, Dai X, Zheng Y, et al. On-column refolding purification of DT389-hIL13 recombinant protein expressed in Escherichia coli. Protein Expres Purif, 2011, 75(1):83-88.

[19] Fan X, Xu D, Lu B, et al. Improving the refolding of NTA protein by urea gradient and arginine gradient size-exclusion chromatography. J Biochem Bioph Meth, 2008, 70(6):1130-1138.

[20] Wang F, Liu Y, Ma G, et al. Glycerol-assisted hydrophobic interaction chromatography improving refolding of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor. Appl Biochem Biotech, 2009, 159(3):634-641.

[21] Nara TY, Togashi H, Sekikawa C, et al. High-throughput protein refolding screening method using zeolite. Biotechnol Prog, 2009, 25(4):1071-1077.

[22] Dechavanne V, Barrillat N, Borlat F, et al. A high-throughput protein refolding screen in 96-well format combined with design of experiments to optimize the refolding conditions. Protein Expres Purif, 2011, 75(2):192-203.

[23] García-Fruitós E, González-Montalbán N, Morell M, et al. Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins. Microb Cell Fact, 2005, 4(1):27.

[24] Jevsevar S, Gaberc-Porekar V, Fonda I, et al. Production of nonclassical inclusion bodies from which correctly folded protein can be extracted. Biotechnol Prog, 2005, 21(2):632-639.

[25] Peternel S, Grdadolnik J, Gaberc-Porekar V, et al. Engineering inclusion bodies for non denaturing extraction of functional proteins. Microb Cell Fact, 2008, 7(1):34-42.

[26] Lu SC, Lin SC. Recovery of active N-acetyl-d-glucosamine 2-epimerase from inclusion bodies by solubilization with non-denaturing buffers. Enzyme Microb Tech, 2012, 50(1):65-70.

[27] Sans C, García-Fruitós E, Ferraz RM, et al. Inclusion bodies of fuculose-1-phosphate aldolase as stable and reusable biocatalysts. Biotechnol Prog, 2012, 28(2):421-427.

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.008

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2011ZX09506-007）

610052 成都，中國醫(yī)藥集團總公司四川抗菌素工業(yè)研究所（羅莉）；610023 成都生物制品研究所有限責任公司（李坤、王保成、王明蓉）

王明蓉，Email：mignrongw2007@163.com

2012-05-03