戴啟宇，楊廷桐，于芳芳

尋找疾病標志物一直是醫(yī)學界探索研究的重要領域。標志物在早期診斷、個體化治療、預后判斷等諸多方面都具有重要價值。新近研究發(fā)現(xiàn)：血液中micro RNA（miRNA）能夠游離于細胞之外，穩(wěn)定存在于循環(huán)血液中，其在組織或血清中的異常表達與多種人類疾病密切相關[1]，并在多種疾病診斷和預后判斷中顯示了獨特價值。血清miRNA檢測，不僅創(chuàng)傷小、方法簡便、結果準確可靠，且還可以改進疾病診斷、癌癥分類、預后評估、療效及復發(fā)預測的精度?？梢妋iRNA已具備了疾病標志物的特點。目前，檢測血液中miRNA表達譜的技術已經(jīng)成熟，精確度和靈敏度可滿足臨床需求，因此，miRNA有望成為血液中新興的疾病診斷和預后判斷的分子標志物。

1 miRNA的生物學特征及功能

1.1 生物學特征 miRNA是一組由動物、植物和病毒基因組所編碼的一類分子非編碼單鏈RNA，長約19～25個核苷酸，它們不具有開放閱讀框（ORF），不編碼蛋白質，但卻參與機體的各種重要的生理和病理過程，它們能夠與靶mRNA的3＇-UTR（untranslated region）區(qū)的堿基互補配對而起作用，使其翻譯受到抑制，從而在轉錄后水平對生物體內(nèi)基因時序性表達起到精細調(diào)節(jié)作用[2]，對機體生長、發(fā)育及各種疾病尤其是腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)功能[3]。幾乎成為基因表達強有效的調(diào)控因子，據(jù)推測人類約有1/3基因編碼的mRNA受到miRNA的負調(diào)控[4]。研究表明，每個miRNA可能調(diào)節(jié)數(shù)百個靶基因，參與生命活動中眾多的信號轉導途徑，在細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應及血管生成等一系列過程中發(fā)揮作用[5，6]。具有嚴格的時空性和組織的特異性。

1.2 生物學功能 眾所周知，血漿或血清中存在大量的外切酶，已有實驗顯示裸露的mRNA或miRNA在加入血漿或血清中后會很快降解[7]。因此，miRNA肯定不是以裸露的形式存在于血漿、血清中，一定存在某種保護機制來抵抗RNA酶的作用。血漿、血清miRNA的功能研究的前提是應該闡明其存在形式、釋放機制、受體細胞是如何接受的等問題。已有證據(jù)顯示細胞在生理或病理狀態(tài)下，能釋放或脫落某些具有膜結構的微泡，直徑從數(shù)十納米至數(shù)微米不等，按照大小或來 源 不 同 取 名 為 exosome、microparticle、microvesicle、apoptoticbody等，這些微泡中就含有miRNA，其膜結構可以抵抗RNA酶對miRNA的酶切作用，推測這是miRNA能穩(wěn)定存在于血漿、血清中的主要原因。盡管已有利用微泡中的miRNA作為疾病標志物在非小細胞肺癌 、卵巢癌以及口腔腫瘤中的研究報道[8]，但微泡之中成分復雜，除了miRNA之外，還富含蛋白質、DNA和RNA，因此沒有很好的對照，很難將某種由微泡導致的生物學效應完全歸因于其中的某種miRNA。Zerecke等[9]利用miR-126特異性敲除小鼠，研究了微泡中miR-126的功能。他們發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞釋放的微泡中miR-126的含量最高，并且顯著高于來源內(nèi)皮細胞的含量；這些微泡在被內(nèi)皮細胞接受的同時，將miR-126傳遞給受體細胞，miR-126在受體細胞內(nèi)含量的增加，通過抑制CXCL12上游的負調(diào)控因子RGS16，致CXCL12表達量上調(diào)：利用ApoE（-/-）小鼠在高脂餐誘發(fā)的動脈粥樣硬化動物模型中研究發(fā)現(xiàn)，CXCL12表達量增高后，可以促進lin-Sca-1+內(nèi)皮祖細胞在粥樣斑塊形成之初就聚集在斑塊周圍，進行損傷修復，從而減少斑塊面積，防止斑塊形成，維持斑塊穩(wěn)定。這項研究，首次正面回答了血漿、血清miRNA是否具有生物學活性的問題，并且提供了血漿、血清miRNA研究可供借鑒的思路。

2 miRNA檢測的方法學研究

目前國內(nèi)外采用血中miRNA檢測方法主要有：miRNA芯片、高通量測序法（Illina／Solexa）、Northern blot法和熒光實時定量逆轉錄PCR（QRT-PCR）法等[10]。提取需要的血液樣本量，從100 μl到2 ml不等，Chen等[11]的研究就采用Solexa測序方法，并且可以發(fā)現(xiàn)和鑒定新的miRNA分子，但是價格偏高。相比之下miRNA芯片（microarray）要比測序方法價格便宜許多，缺點是重現(xiàn)性和準確性比較差，只用于疾病相關循環(huán)miRNA的初篩，這種方法只能對已知的miRNA進行檢測，無法尋找和發(fā)現(xiàn)新的miRNA分子。Northern blot方法繁瑣且靈敏度低，不宜用于高容量檢測。那么miRNA血中表達與量檢測的最好方法是QRT-PCR法，此法操作簡便、快速、高效、敏感性高和特異性強。Chen等使用10 μl血清進行不提取RNA，直接QRT-PCR分析的結果，與血清提取RNA后進行QRT-PCR分析的結果一致。如能優(yōu)化這種方法將顯著減少血清用量、步驟及成本。采用Taqman探針或者SYBR熒光染料檢測的QRT-PCR法主要是基于莖-環(huán)的RT-PCR方法（stem-loop RT-PCR）和基于poly（A）加尾的TR-PCR方法。前者特異性更高，后者通用性好。

3 miRNA在臨床醫(yī)學中的研究

從2008年血漿、血清中存在miRNA最早被報道后，對它的研究一直方興未艾，至今所涉及的疾病領域主要為腫瘤和非腫瘤兩大類。

3.1 腫瘤類疾病 miRNA在不同條件下可行使癌基因或抑癌基因的功能，有些miRNA表達具有組織特異性，如miR-122僅在肝臟中表達，有些miRNA在腫瘤中表達上調(diào)，如：miR-21在成膠質細胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等[12]。有些miRNA在腫瘤中表達下調(diào)，如：miR-15a和miR-16在垂體腺瘤和慢性B型淋巴細胞性白血病等[13]。let7家族在肺癌中下調(diào)，預示肺癌的發(fā)生及術后生存期短，此外，MYC蛋白的過表達也可以直接抑制let7家族的活性[14]。miR-122的調(diào)控功能涉及肝臟細胞生長、代謝、蛋白表達和病毒感染等多種過程，miR-122下調(diào)表達和肝癌發(fā)病密切相關。miR-25、miR-34家族調(diào)節(jié)p53的表達，在多種腫瘤中起重要的調(diào)控作用[15，16]，而且miR-34b/miR-34c在胃癌和神經(jīng)母細胞瘤等腫瘤中均表達下調(diào)。此外，miR-145的表達下調(diào)與乳腺癌和結腸癌發(fā)病風險相關。在腫瘤組織下調(diào)表達的miRNA靶基因大部分增強了細胞的生長、發(fā)育或增值活性，當miRNA表達下調(diào)時，這些基因過量表達導致細胞生長失去控制，發(fā)生癌變。

血清中是否存在miRNA相對應的表達譜，一直是研究者所關注的問題，2008年至今已有多項血清miRNA與腫瘤關系的研究報道，這就為血清miRNA作為分子標記應用于臨床腫瘤的早期診斷和預后提供了工作基礎。血中的miRNA主要來自組織細胞的主動分泌過程[17]，成熟的miRNA在細胞內(nèi)被脂質或脂蛋白包被成外切酶體（Exosome），分泌至胞外并進入血液去掉包被，釋放出miRNA發(fā)揮其生物學功能[18]。外切酶體介導的細胞間miRNA交換，是細胞通訊的一種新的途徑，對維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有重要作用[19]。

3.1.1 消化道腫瘤 2010-02血漿中的miR-92被成功用作診斷結直腸癌的分子標志物，靈敏度可達89%，特異性達到70%，術后顯著降低；更加令人興奮的是，通過miR-92作為分子標志物可以診斷Ⅰ～Ⅳ期的結直腸癌，而早期診斷可以大大提高生存率和改變預后[20]。Huang等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-29a和-92a在CRC患者血漿中明顯增高。Wang等[22]研究了胰腺導管腺癌（pancteaticductal adeenocarcinoma，PDA）患者血漿中miRNA的水平，發(fā)現(xiàn)miR-155的水平在腫瘤形成的早期就明顯增高，而miR-196a的水平高低和患者病程相關，其靈敏度和特異度分別是64%和89%。Tsujiura等[23]對胃癌患者血漿中miR-21、-106a、-106b、-17-5p和let-7a的水平與健康人進行了比較，發(fā)現(xiàn)在胃癌患者血漿中l(wèi)et-7a明顯降低，而其余4個miRNA均顯著增高。

3.1.2 肺癌 Chen等[24]挑選了利用測序技術發(fā)現(xiàn)的在肺癌患者中具備有效拷貝數(shù)的miR-25和-223兩種miRNA顯著上調(diào)。Hu等[25]為研究血清miRNA在肺癌患者預后判斷中的作用，挑選了60例Ⅰ～Ⅲa期的肺癌患者，這些患者均接受手術和化療，按照生存期的長短分為較長和較短生存期2個亞組各30例，所有患者的血清均采用高通量測序技術，發(fā)現(xiàn)至少11個miRNA的變化在5倍以上，在隨后243例肺癌患者血漿標本的驗證過程中，發(fā)現(xiàn)其中miRNA-486、-30d、-1和-499可以作為總生存率獨立的預測因子，亦可作為肺癌檢測的標志物。miRNA幾乎參與了肺癌病變進程的每一個環(huán)節(jié)，對基因的調(diào)控改變了腫瘤表達狀態(tài)[26，27]。

3.1.3 血液系統(tǒng)腫瘤 ①彌漫性大B細胞淋巴瘤：關于血清中miRNA是否可運用于腫瘤診斷研究，最早的報道來自Lawrie等[28]在大 B細胞淋巴瘤 （diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）的研究，他們挑選了和腫瘤相關miR-155、-210、-21，比較了在DLBCL患者和健康人群之間血清水平的差異，發(fā)現(xiàn)DLBCL患者血清中三者的含量均顯著高于健康人，且血清miR-21的不同水平?jīng)Q定了患者不同的生存曲線；與此前miR-21與預后良好正相關的報道吻合；②急性白血病：Tanaka等[29]利用miRNA芯片比較了急性白血?。╝cute leukemia，AL）患者和健康人之間的血漿miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)運用miR-92a和-638的比值能顯著的區(qū)分AL患者和健康人；進一步運用原位雜交技術發(fā)現(xiàn)，無論是急性髓細胞白血病和急性淋巴細胞性白血病患者，其腫瘤細胞中miR-92a的含量均明顯增高，而在健康人中含量微弱。

3.1.4 乳腺癌 在對乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)：血清miR-155水平在乳腺癌和非乳腺癌患者中沒有顯著性差異，但miR-155在孕酮受體陽性的乳腺癌患者血清的表達水平高于孕酮受體陰性的患者[30]，提示miR-155可以作為區(qū)分激素敏感性和非敏感性的乳腺癌患者的分子標志物，進一步證明血清miRNA具有成為腫瘤診斷和預后標志物的潛力。Heneghan等[31]挑選了和乳腺癌相關的7個miRNA在乳腺癌患者的腫瘤組織和血漿中進行了比對，發(fā)現(xiàn)miR-195是乳腺癌組織特異的miRNA，在血漿中的水平均要高于正常，能很好地反映患者腫瘤生長的臨床病理特征，并與淋巴轉移以及孕酮受體的狀態(tài)等均密切相關。miR-21的改變與腫瘤耐藥有密切關系[32]。

3.1.5 口腔腫瘤 在對舌鱗狀上皮細胞癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-184在癌組織中的表達提高了59倍以上，患者術后的血漿miR-184表達量降低到只有原來的1/10，這表明血清中miRNA表達譜的變化與腫瘤組織關系密切，血清miRNA表達譜有可能替代組織miRNA表達譜作為口腔腫瘤標志物[33]。正常人血清含量很低或無法檢測到，而在腫瘤患者血清中含量較高的miRNA可以確認為腫瘤的分子標志物。上述研究結果顯示，血清miRNA與腫瘤組織中miRNA的表達譜相關，在以后進一步的研究中將加速血清miRNA作為腫瘤標志物應用于臨床檢測的進程。

3.2 非腫瘤類疾病 非腫瘤類疾病主要包括妊娠、組織損傷、敗血癥、心衰等研究領域。

3.2.1 妊娠 在對孕婦血研究中進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-141在早、中、晚期妊娠階段的含量各不相同，在妊娠晚期含量最高[34]。Gilad等[35]也發(fā)現(xiàn)孕婦血漿中miR-526a、miR-527、miR-520d-5p的含量比正常人高出數(shù)百倍，分娩后即下降，因此建議以這3條miRNA的含量來判斷孕婦是否妊娠，并可用于異位妊娠的診斷。

3.2.2 組織器官損傷

3.2.2.1 急性組織損傷 Laterza等[36]為了闡明血漿中組織特異來源的miRNA能作為組織損傷特異標志物的概念，制備了3種組織特異損傷的動物模型，分別對骨骼肌特異的miR-133a、肝組織特異的miR-122，以及腦組織特異的miR-124含量進行血液檢測，發(fā)現(xiàn)miR-133a和miR-122分別在骨骼肌和肝組織損傷后明顯增高，升高倍數(shù)達到數(shù)百倍至數(shù)千倍，而此時傳統(tǒng)的骨骼肌損傷和肝損傷標志物肌酸激酶（creatine kinase，CK）、 丙氨酸轉氨酶 （alanineaminotransferase，ALT）、 天冬氨酸轉氨酶 （asparate eaminotransferase，AST）輕度增高或增高數(shù)十倍，結合病理染色，發(fā)現(xiàn)miR-122診斷肝損傷的敏感性要優(yōu)于ALT。同時，在大惱中動脈閉塞后8 h的大鼠血漿中能明確檢測到腦組織特異的miR-124的增高，24 h增高的更加明顯。這些研究結果不僅表明骨骼肌、肝組織、腦組織特異的miRNA能作為骨骼肌損傷、肝組織、腦組織損傷特異標志物，并且可拓展至所有組織特異的miRNA都能作為該組織損傷特異標志物的科學概念。

3.2.2.2 肝損傷 Wang等[37]比對惱、心、肝、脾、腎、肺6個組織和血漿miRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)血漿中miRNA的來源非常廣泛，然后利用過量對乙酰氨基酚（acetaminophen）灌胃制備藥物性肝損傷小鼠模型，在造模24 h的時候，對損傷前后肝組織、血漿中miRNA的表達譜進行比對，發(fā)現(xiàn)共有20個miRNA在肝組織和血漿中均存在明顯變化，其中17個具有相反的改變趨勢，其中miR-122、-192在造膜后血漿中明顯增高而肝組織中顯著降低；隨后針對miR-22、-101b、-122、-133a、-135*、-192、-193和-486進行了時間和計量的深入研究，發(fā)現(xiàn)這些miRNA在血漿中的含量和對乙酰氨基酚灌胃呈現(xiàn)很好的時間、劑量依賴性；不僅如此，肝臟特異的miR-122和-192能在150 mg/kg對乙酰氨基酚灌胃1 h的時候就能在血漿中檢測到顯著的升高，而血漿中ALT的含量尚未有明顯的改變，說明血漿miRNA反映肝臟損傷的靈敏度要優(yōu)于ALT。新近研究發(fā)現(xiàn)肝炎、肝硬化患者血中miRNA-192、-122含量較正常人明顯升高[38]，用實時熒光定量Ri-PcR檢測慢性乙肝及肝病患者血清中miR-21、miR-122、miR-223，顯示比健康人顯著升高，且乙肝患者比肝病患者升高更顯著，因此，推測這些miR可作為乙肝患者肝損傷的分子標志物[38]。

3.2.2.3 急性心肌損傷 JI等[39]為研究心臟組織特異miRNA能否作為心肌損傷的標志物，首先比對了心、腎、肝、骨骼肌miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-208和-490在心臟特異高表達，在隨后多種組織的定量PCR驗證過程中，發(fā)現(xiàn)miR-208是嚴格意義心臟特異表達的miRNA，并以此為備選標志物；然后利用異丙腎上腺素（320 mg/kg）皮下注射的方法制備了急性心肌損傷大鼠模型，在不同時間點進行了血漿miR-208定量檢測，繪制了含量--時間變化曲線，同時與肌鈣蛋白比較發(fā)現(xiàn)miR-208在造模3 h即能在血漿中檢測到顯著性增高，這種增高一直持續(xù)至12 h，在24 h后血漿miR-208的含量呈現(xiàn)下降趨勢；同時在急性腎梗塞、心肌肥厚的動物模型中沒有發(fā)現(xiàn)血漿 miR-208的增高，提示心臟特異miRNA不僅可能是新穎的心肌損傷監(jiān)測標志物，同時還提示了在某些肌鈣蛋白升高的非心梗疾患中的應用前景。AI等[40]則針對心肌組織高表達，同時在心肌缺血后會表達增高的miR-1，對急性心梗人群和非心梗人群血漿中的含量進行了研究，他們發(fā)出miR-1在急性心梗人群中的含量要高于非心梗人群，其含量和心電圖QRS波的寬度存在正相關性，提示血漿中心臟高表達的miRNA可作為急性心梗診斷新的標志物，可能對急性心梗的預后判斷具有一定的價值。

Wang等[41]從理想的心肌標志物的特征出發(fā)，篩選了心臟特異高表達而血漿中缺乏或含量微弱的miRNA作為候選標志物，包括miR-208a、-499、-133a和-1，利用開胸結扎前降支的方法制備了急性心梗動物模型，發(fā)現(xiàn)這4個miRNA在冠脈結扎1 h后均能檢測到明顯的增加，在6～12 h血漿中含量達到高峰，24 h的時候顯著下降，結合miRNA的表達譜以及單純開胸不結扎冠脈的假手術組血漿中miR-133a、-1和-499也出現(xiàn)不同程度增加的現(xiàn)象，他們認為心臟特異的miR-208a是一個較好候選標志物。隨后在小樣本的人群中，研究發(fā)現(xiàn)血漿中這4個miRNA的平均水平在急性心梗人群中顯著高于非心梗人群，這種差異能有效地區(qū)分心梗人群（ROC分析曲線下面積均在0.8以上）；尤其是miR-208a，在非心梗人群中檢測不到 （PCR結果CT值>40），而在90.9%（30/33）的心梗人群中能檢測到顯著增高。進一步對急性心梗人群按照胸痛時間進行亞組分析時發(fā)現(xiàn)，在胸痛4 h以內(nèi)miR-208a對急性心梗的檢出率要高于肌鈣蛋白，提示血漿miRNA很可能作為急性心梗新的診斷標志物。

3.2.3 心力衰竭 通過定量PCR檢測心衰（HF）患者的血漿miRNA表達譜并和健康志愿者相比對，發(fā)現(xiàn)僅有miR-423-5p和-18b*能在胸悶患者中區(qū)分HF和非HF，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-423-5p和血清中腦鈉肽 （brain natriuriceptide，BNP） 存在正相關 （R=0.43，P=0.002）， 和左心室射血分數(shù)（EF%）存在負相關（R=0.34，P=0.023），提示血漿miR-423-5p是一種有潛力的心衰分子標志物[42]。

3.2.4 敗血癥 Vasilescu等[43]首先對比了敗血癥患者白細胞miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)在所有敗血癥患者中均出現(xiàn)變化的miRNA有4個，miR-150和-342-5p均下調(diào)，miR-182和-486均上調(diào)；進一步研究發(fā)現(xiàn)血漿miR-150的含量和患者序貫性器官衰竭評分 （SOFA）分值呈負相關，其中促炎因子TNFa和抗炎因子IL-10-IL-18在敗血癥患者的血漿中均顯著上升，其含量和miR-150的血漿含量呈負相關，利用血漿IL-18和miR-150的比值，進一步可以區(qū)分miR-150含量不同的敗血癥患者。Wang等[44]經(jīng)過綜合研究發(fā)現(xiàn)，血液中miR-146a和-223含量能有效的區(qū)分感染和非感染原因導致的敗血癥和系統(tǒng)性炎癥反應綜合征（SIRS）患者，當特異度為100%時，其靈敏度分別是63.3%和80%。

4 microRNA作為腫瘤標志物的應用

4.1 優(yōu)勢 檢測時損傷小、穩(wěn)定性好、靈敏度高、可用于早期腫瘤的檢測。

4.2 缺點 血清中miRNA的含量較低，一般方法學不易檢測。

4.3 方法學 尋找一種靈敏度高、操作簡單且成本低廉的檢測方法，這是血清miRNA應用于腫瘤臨床檢測急待解決的問題。

4.4 選擇合適的內(nèi)參 內(nèi)參的穩(wěn)定性，決定了檢測結果的可靠性，以消除樣品間RNA含量的差異。目前可供選擇的內(nèi)參如：RNU6B,miR-16，miR-24，miR-142-3P，人工合成的外源miRNA及總 RNA等。若同時檢測幾種 miRNA，用geNORM，NormFinder，Bestkeeper和REST等軟件進行分析，選擇一種或多種變異度較小的miRNA作為內(nèi)參[45]。

4.5 檢測技術 電化學傳感器檢測技術的使用，該方法檢測靈敏度可達到0.1 pmol，足以滿足檢測血清miRNA的條件[46]。且實時熒光定量PCR技術也是一種優(yōu)越方法。

4.6 選用上調(diào)標志物 優(yōu)先選擇在腫瘤中表達上調(diào)的血清miRNA，這樣可提高檢測的靈敏性和特異性[47]。

4.7 多種標志物聯(lián)合使用 僅僅采用一種血清miRNA作為腫瘤標志物往往特異性不足，若將多種miRNA組合使用并與其它類型腫瘤標志物檢測相結合，可望顯著提高診斷的準確性。

4.8 變異性 個體間血清miRNA變異較大，探尋腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同時期個體血清miRNA表達譜的變化規(guī)律并闡明作用機理，是將miRNA檢測應用于惡性腫瘤個體化診斷的一個關鍵問題。

總而言之，很早以前人們致力于血清中疾病標志物的研究，但多因不夠穩(wěn)定和特異性差而臨床應用前景并不樂觀。然而miRNA最新的研究結果卻令人驚喜，miRNA具有很強的細胞、組織或疾病特異性，這些特異性表達既是其功能研究的基礎，又是很好的疾病標志物。Chen[48]利用更加靈敏、特異的高通量測序技術，對血清中所有 18～30 nt的小片段RNA進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在男性和女性血清中分別有100種和91種miRNA。在不同的環(huán)境條件下miRNA在血中仍保持相對穩(wěn)定，顯示了作為理想的疾病標志物所需的某些特征，開創(chuàng)了血中miRNA研究的先河。不僅如此，在血液之外的其他體液，如：唾液、痰中以miRNA作為肺癌、口腔腫瘤標志物的研究也顯示了很好的價值。血液中miRNA作為新興的腫瘤分子標志物在未來的腫瘤臨床診斷和治療中將會顯示更好的應用前景[49]。相信隨著研究的深入和拓展，將會發(fā)現(xiàn)越來越多的血清miRNA作為疾病診斷和預后的標志物，同時血清miRNA的功能研究，必將成為標志物研究之后的又一大熱點。

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