黃麗君 綜述，姚正國 審校（湖北省黃岡市黃州區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 438000）

α－L－巖藻糖苷酶（a－L－Fucosidase，AFU）是一種溶酶體酸性水解酶，廣泛分布于人體內(nèi)的各種組織、細(xì)胞及體液中。1977年研究者在動物實驗中觀察到Morris鼠肝癌組織中AFU活力較正常肝臟高7倍，且與腫瘤生長期有關(guān)。1980年法國學(xué)者首先在3例原發(fā)性肝癌血清中發(fā)現(xiàn)AFU活性升高，并提出把AFU作為診斷肝癌的一種新的標(biāo)志酶，并被后來的眾多研究所證實。近年來，AFU檢測的方法學(xué)研究，及腫瘤或非腫瘤性疾病的血清AFU水平變化的研究也日益增多，并且有不同的評價。

1 AFU的生物學(xué)特性

AFU是一種溶酶體酸性水解酶，廣泛分布于人體各種組織及體液中，如胎盤、胎兒組織、腦、肺、肝、胰、腎，以及血清、尿液、唾液、淚液等均含有AFU。其中以肝、腎等組織活性較高，細(xì)胞內(nèi)的AFU主要位于溶酶體內(nèi)。健康人血清AFU的相對分子質(zhì)量達(dá)（270～390）×103，亞單位的相對分子質(zhì)量為（56.0±2.8）×103和（54.0±2.7）×103，大約有8%左右的健康人血清AFU呈低活力。白細(xì)胞AFU的相對分子質(zhì)量為（30～130）×103，肝臟 AFU的相對分子質(zhì)量為（220～240）×103，亞單位的相對分子質(zhì)量為（53.00±2.65）×103和（49.00±2.45）×103［1］。用神經(jīng)氨酸苷酶處理后，血清AFU相對分子質(zhì)量顯著下降到（37±4）×103。而且他們在等電聚焦電泳中行為出現(xiàn)顯著改變，在pH 3.8～5.9范圍的酶活性基本消失，而在pH 6.0～7.2范圍的酶活性增高。分子三級結(jié)構(gòu)的改變和（或）較多唾液酸的聚集可能是AFU相對分子質(zhì)量較大的原因。經(jīng)過1%十二烷基硫酸鈉（SDS）和5%巰基乙醇處理的血清、肝的AFU，用聚丙烯酰胺凝膠電泳可見2種相對分子質(zhì)量十分接近的亞單位。

有資料顯示，用聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳分析純化的人血清AFU同工酶顯示出2條主帶及5條細(xì)帶；用蔗糖密度梯度層析法分析透析后的人血清AFU同工酶顯示出8條同工酶區(qū)帶，用Sephadex G200薄層等電聚焦及Aephadex G25柱等電聚焦分離AFU同工酶，可出現(xiàn)6條區(qū)帶；用瓊脂糖凝膠作為支持物做等電聚焦電泳，出現(xiàn)8條同工酶區(qū)帶［1］。說明人體AFU分子根據(jù)其糖鏈組成與結(jié)構(gòu)不同，可出現(xiàn)不同的同工酶表現(xiàn)形式，其原因可能與下列因素有關(guān)：（1）與結(jié)構(gòu)基因有關(guān)；（2）與酶蛋白四級結(jié)構(gòu)的差異有關(guān)；（3）與AFU分子中唾液酸含量有關(guān)。

AFU的反應(yīng)特性：腦與肝AFU具有抗原一致性，用肝AFU制備的抗體IgG可與純化的血清AFU發(fā)生免疫沉淀反應(yīng)；血清AFU的反應(yīng)最適在pH 4.8左右，在pH 6.1處可出現(xiàn)一個次要的“最適”pH峰，與腦、肝AFU的pH反應(yīng)曲線類似，而且3者的Km值比較接近，提示血清和腦、肝AFU之間存在抗原特性和動力學(xué)特征的一致性。

2 AFU的測定方法

2.1 熒光法 研究者利用AFU水解4－甲基傘型酮－α－L－巖藻吡喃糖苷釋放4－甲基傘型酮，用堿性緩沖液終止反應(yīng)，并使產(chǎn)物呈現(xiàn)熒光，用360nm或365nm激發(fā)波長和400nm或448 nm發(fā)射波長檢測熒光強(qiáng)度，對照不同濃度4－甲基傘型酮制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線求酶的活性，此法敏感性高，適用范圍廣。但該法對儀器條件要求高，不適合用于自動化檢測。

2.2 終點比色法 以對硝基苯酚α－L－巖藻糖苷為底物，在AFU催化下生成α－L－巖藻糖苷和對硝基苯酚，對硝基苯酚在堿性溶液中呈黃色［2］，用分光光度計在405nm波長處檢測。本法反應(yīng)時間長，且操作較繁瑣，干擾因素多，也不適用自動化檢測。于秀艷等［3］對其進(jìn)行了改進(jìn)，利用對硝基酚毫摩爾消光系數(shù)為18.5的特性，根據(jù)AFU在pH 5.0的條件下催化對硝基苯－巖藻糖吡喃糖苷，生成對硝基酚和巖藻糖，在405nm波長下，對硝基酚有一吸收高峰，測其吸光度變化，不必做標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可準(zhǔn)確測出AFU含量。因本法采用因數(shù)兩點法，可去除因溶血黃疸給試驗帶來的干擾。

2.3 速率法（連續(xù)監(jiān)測法） 血清中AFU催化2－氯－對硝基酚α－L－巖藻吡喃糖苷（CNP－F）水解生成2－氯－對硝基酚（CNP），在405nm或410nm波長監(jiān)測CNP的生成速率，計算出AFU活性。本法測定對膽紅素250mg／L、血紅蛋白230mg／L、抗壞血酸6g／L無明顯干擾［2］。該法操作簡便，測定時間短，靈敏度和抗干擾性都有提高，適用于各種半／全自動分析儀器。依據(jù)底物的不同，速率法又可分為PNP法、CPNP法、MGCNPF法3種。PNP法底物為對硝基苯α－L－巖藻吡喃糖苷，靈敏度一般，對溶血、黃疸仍表現(xiàn)出一定的基質(zhì)效應(yīng)，精密度也較差。CPNP法采用氯化對硝基苯α－L－巖藻吡哺糖苷作底物，靈敏度和精密度較PNP法都有了很大的改善，但仍未完全解決溶血、黃疸及脂血的基質(zhì)效應(yīng)。MGCNPF為新型底物，靈敏度、精密度、抗干擾性及試劑穩(wěn)定性都很高，是當(dāng)前最為先進(jìn)的檢測方法。

3 AFU的臨床意義

AFU是在20世紀(jì)70年代用于診斷一種AFU缺乏的遺傳病，因先天缺乏AFU可以引起巖藻糖貯積病，對組織細(xì)胞、尿液和血清中AFU測定可協(xié)助該病的診斷，并借以與其他遺傳性粘多糖貯積病鑒別。自1980年有研究者發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌患者血清AFU升高，并被后來的研究證實之后，國內(nèi)外許多學(xué)者對AFU在臨床應(yīng)用方面進(jìn)行了大量的探討。從此，對AFU的臨床意義有了全新認(rèn)識。

3.1 原發(fā)性肝癌（primary hepatic cancer，PHC） 近20多年來，有關(guān)AFU于肝癌的相關(guān)性研究眾多。有資料表明，血清AFU對原發(fā)性肝癌診斷的陽性率在64%～84%之間，特異性在90%左右。血清AFU活性升高幅度和陽性率于AFP無相關(guān)性［4］。AFU血清水平和陽性率與腫瘤大小無關(guān)，病灶小于3cm的患者血清AFU升高的陽性率為70.8%～80.0%，明顯高于AFP的陽性率（37.5%～40.0%）。何謙等［5］通過誘發(fā)大鼠肝癌的動物實驗發(fā)現(xiàn)，AFP直到第18周肝癌演變期與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而AFU從第14周早期肝癌形成期就與健康對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并且隨著肝癌的動態(tài)發(fā)展過程進(jìn)一步升高，從而證實AFU對原發(fā)性肝癌具有較高的診斷學(xué)價值。

3.2 肝炎和肝硬化 大多數(shù)肝硬化和一部分乙肝患者的血清AFU活性均有不同程度的升高，可能與肝細(xì)胞損傷、酶逆流入血有關(guān)。乙肝患者血清AFU活性和血清ALT活性的升高程度具有高度的正相關(guān)。經(jīng)抗肝炎治療后，血清ALT活性下降，AFU活性也迅速下降，ALT活性持續(xù)不變或上升者，AFU活性也不下降。肝硬化患者血清AFU活性長期升高提示易發(fā)展為肝癌，或表示病情危險，或已有小病灶肝癌存在。所以血清AFU活性測定有助于乙肝病情發(fā)展的預(yù)測及肝硬化患者預(yù)后的觀察［6］。

3.3 白血病 曾有報道B細(xì)胞性慢性淋巴細(xì)胞白血病患者白細(xì)胞AFU活性明顯低于其他類型白血病，并認(rèn)為這與B細(xì)胞屬性無關(guān)，而是惡性細(xì)胞的增殖產(chǎn)物。趙平等［7］報道，急性白血病患者血清AFU活性高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。M4、M5患者血清AFU活性與外周血單核細(xì)胞數(shù)的對數(shù)呈顯著正相關(guān)，提示升高的血清AFU可能來源于單核細(xì)胞系統(tǒng)。

3.4 卵巢腫瘤 洪開聽等［8］測定101例婦科各型腫瘤患者及50例健康對照組AFU活性發(fā)現(xiàn)，90%的惡性卵巢腫瘤患者血清AFU活性明顯低于婦科其他腫瘤及健康對照組，且與疾病分期、腫瘤負(fù)荷、組織學(xué)分型和腫瘤分化程度無關(guān)。惡性卵巢癌患者血清AFU活性降低可能與遺傳因素有關(guān)。以275kU／L為臨界值，據(jù)此診斷卵巢惡性上皮癌的敏感性和特異性分別為88.5%和98.5%。因此，AFU也可以作為卵巢癌的一個特異診斷指標(biāo)。

3.5 健康孕婦 樊國萍［9］測定了177例健康孕婦和69例健康未懷孕對照組的血清AFU活性，并將妊娠組按孕周數(shù)不同分為早孕組（1～12周）、中孕組（13～27周）、晚孕組（28～40周）。發(fā)現(xiàn)妊娠組與健康未懷孕對照組相比血清AFU水平升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；比較3組AFU水平發(fā)現(xiàn)晚孕組AFU水平高于早、中孕組（P＜0.01，P＜0.05），中孕組高于早孕組（P＜0.05），并伴隨著妊娠周數(shù)的增加AFU水平呈升高趨勢，在自然分娩或人工終止妊娠后迅速下降，5d后降至正常。因此，孕婦血清中AFU增高應(yīng)視為妊娠過程中的特殊生理反應(yīng)，不同于肝病時的升高，臨床醫(yī)生應(yīng)加以區(qū)別。

3.6 糖尿病 權(quán)翠俠等［10］對75例糖尿病患者和39例健康者進(jìn)行了AFU活性測定，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者AFU水平明顯高于健康對照組，血糖控制差的糖尿病患者其AFU酶活力與同時測定的空服血糖（FBG）和糖化血紅蛋白（HbA1c）存在顯著正相關(guān)，而糖控制好的糖尿病患者組AFU酶活力與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且與FBG和HbA1c不相關(guān)。說明糖尿病患者AFU升高與糖代謝控制的好壞有關(guān)，糖尿病患者血清AFU明顯高于健康對照組，糖代謝控制差的患者血清AFU與FBG、HbA1c有顯著正相關(guān)。這一結(jié)果說明糖尿病患者血清AFU可反映HbA1C和FBG所提示的糖代謝控制現(xiàn)狀。

3.7 腹腔積液 段俊林和歐超偉等［11］測定了128例各種病因引起的腹腔積液標(biāo)本，并按照疾病性質(zhì)將腹腔積液分成惡性腹腔積液組和良性腹腔積液組。結(jié)果顯示，在惡性腹腔積液組中AFU活性均高于良性腹腔積液組，診斷敏感性為80.0%，特異性為87.3%，而且診斷準(zhǔn)確率達(dá)83.6%，表明AFU活性檢測可作為良、惡性腹腔積液鑒別診斷的一種較好標(biāo)志物。

3.8 肺部疾病 楊沛等［12］檢測了臨床診斷明確的肺部疾病患者97例，結(jié)果顯示，除慢性阻塞性肺疾病患者血清AFU顯著低于健康人及其他肺部疾病患者外，其他肺部疾病患者血清AFU均顯著高于健康人。增高的原因可能與感染、免疫紊亂、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝異常，以及腫瘤的抗原性密切相關(guān)。說明AFU與肺部疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，對肺部疾病的診斷與鑒別診斷具有一定的臨床價值［13－15］。

4 結(jié) 語

綜上所述，AFU在原發(fā)性肝癌的研究中正日益引起研究者的重視，并且在對肝炎、肝硬化、白血病、卵巢囊腫、糖尿病和肺部疾病的診斷與治療，以及健康孕婦腹腔積液的相關(guān)檢測中，AFU都有很高的應(yīng)用研究價值。所以，繼續(xù)探討原發(fā)性肝癌患者組織和血清中AFU活性分布規(guī)律和升高機(jī)制，以及進(jìn)行AFU同工酶的分離，制備出AFU的抗體及單克隆抗體，有可能使原發(fā)性肝癌得臨床診斷與導(dǎo)向治療提供更加有效的手段。

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