胡鳳云　莫賤友　韋繼光　郭堂勛　黃穗萍　潘朝勃

摘 要： 初步研究了西、甜瓜蔓枯病病菌差異性，為深入了解西、甜瓜蔓枯病病原提供理論依據(jù)。采用離體葉片接種法對(duì)19個(gè)西、甜瓜蔓枯病菌株進(jìn)行致病力差異性研究，并對(duì)不同菌株核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列（rDNA-ITS）比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同西、甜瓜蔓枯病菌株致病力存在顯著性差異，病情指數(shù)為85.11～4.58；但不同菌株間的ITS序列比較差別不大，保守程度高，菌株間的分化和變異不明顯。

關(guān)鍵詞： 西瓜； 甜瓜； 蔓枯?。?病菌差異性

西、甜瓜蔓枯?。―idymella bryoniae）是一種真菌性土傳病害，危害植株莖基部和節(jié)間部。由于受保護(hù)地特殊生態(tài)環(huán)境條件以及廣西地區(qū)常年高溫高濕氣候的影響，近年來(lái)廣西西瓜和甜瓜病害發(fā)生種類日益增多，數(shù)量越來(lái)越大，危害程度越來(lái)越嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了西、甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，給瓜農(nóng)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。其中，蔓枯病就是西、甜瓜的重要病害之一。據(jù)筆者近幾年的調(diào)查，在南寧市郊區(qū)各西、甜瓜種植基地蔓枯病危害也有加重的趨勢(shì)，武鳴縣武帽農(nóng)場(chǎng)保護(hù)地種植瓜類每年種植二、三茬，由于同類作物不斷連作，造成菌源大量積累，同一大棚內(nèi)春季蔓枯病發(fā)病率為20%～30%，秋季發(fā)病率在80%～100%，損失在 40% 以上。因此深入研究西、甜瓜蔓枯病病菌差異性，對(duì)西、甜瓜蔓枯病防治具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1995年Amand等[1]研究了8個(gè)蔓枯病菌株對(duì)不同葫蘆科作物的致病力，結(jié)果顯示基本無(wú)差異。2008年吳海波等[2]研究了來(lái)自江蘇和海南的4個(gè)蔓枯病菌株的致病力，結(jié)果顯示差異不顯著。江蛟[3]比較了4個(gè)蔓枯病菌株的ITS序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株之間遺傳多樣性不明顯。本研究即利用離體葉片接種法對(duì)西、甜瓜蔓枯病菌株進(jìn)行致病力差異性研究，并對(duì)19個(gè)西、甜瓜蔓枯病菌株的ITS序列進(jìn)行比較分析，以期了解西、甜瓜蔓枯病病菌差異性，不同菌株之間是否存在分化和變異，為深入研究西、甜瓜蔓枯病病原提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病原菌來(lái)源：采自廣西壯族自治區(qū)南寧市郊西、甜瓜各種植區(qū)及柳州、北海、桂林等地具有典型蔓枯病癥狀的西瓜和甜瓜病株樣本，經(jīng)分離、純化獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同菌株對(duì)同一西瓜品種致病力差異研究

在張永兵等[4]的方法基礎(chǔ)上稍做改進(jìn)。試驗(yàn)于2011年9-11月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所科研基地及真菌研究室進(jìn)行。將西瓜種子（西農(nóng)8號(hào)）消毒、播種，出苗后長(zhǎng)至3～5片真葉時(shí)，取其第3～5 片展開(kāi)的幼葉，用滅菌蒸餾水沖洗干凈后，晾干葉片表面水分，用軟毛筆將配制好的孢子懸浮溶液（5×105個(gè)·mL-1）接種至葉片上，然后將其置于滅過(guò)菌鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，另設(shè)內(nèi)含不接種病菌只接滅菌蒸餾水葉片的培養(yǎng)皿為對(duì)照；在 25 ℃ 條件下進(jìn)行培養(yǎng)，光照周期為16 h光照/ 8 h 黑暗，相對(duì)濕度約90 %。每個(gè)處理3片葉，重復(fù)3 次。

接種培養(yǎng)3～4 d后，按以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情級(jí)數(shù)調(diào)查，并計(jì)算出病情指數(shù)。0級(jí)，葉片未發(fā)?。?級(jí)，葉片發(fā)病面積在10% 以下；3級(jí)，葉片發(fā)病面積 10%～25%；5級(jí)，葉片發(fā)病面積 26%～50%；7級(jí)，葉片發(fā)病面積 51%～75%；9級(jí)，葉片發(fā)病面積 76%～100%。

病情指數(shù)按以下公式計(jì)算：

1.2.2 不同菌株核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列（rDNA-ITS）比較

1.2.2.1 蔓枯病菌菌絲的收集 將不同采樣地點(diǎn)（南寧郊區(qū)以及柳州、桂林、北海等地）的19株蔓枯病菌接種于PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后，接入PD液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（25 ℃，80 r·min-1）4～7 d，用滅菌紗布過(guò)濾后，用無(wú)菌水沖洗2～3次，用濾紙吸干水分，冷凍干燥，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 蔓枯病菌總DNA的提取 采用SDS裂解法[5]，其中稍有改進(jìn)，具體步驟如下：（1）將單孢分離培養(yǎng)菌株用滅菌移液槍頭把菌絲體從培養(yǎng)基上輕輕刮下，然后挑到已滅菌的2 mL離心管中。（2）挑黃豆粒大小菌絲到一滅菌的2 mL離心管，每管加2顆用無(wú)水乙醇灼燒過(guò)的鋼珠，加400 μL SDS（十二烷基硫酸鈉）緩沖液；研磨打碎菌絲約20 min，12 000 r·min-1、4 ℃ 離心10 min，取上清液400 μL。（3）加200 μL飽和酚、200 μL氯仿，12 000 r·min-1、4 ℃ 離心15 min，取上清液。（4）加2 μL RNase，37 ℃ 恒溫水浴1 h。（5）加200 μL飽和酚、200 μL氯仿，12 000 r·min-1、4 ℃ 離心15 min，取上清液約350 μL。（6）加上清液2倍體積的無(wú)水乙醇（預(yù)冷）、1/2體積的3 mL NaOAc（預(yù)冷，pH值5.2），輕翻轉(zhuǎn)混勻，-20 ℃ 凍30 min。（7）12 000 r·min-1、4 ℃ 離心10 min，棄上清液（慢慢倒，小心DNA被倒出），簡(jiǎn)單離心，用移液槍吸走多余液體。（8）加100 μL 70% 酒精洗DNA 2～3遍，烘干。（9）加50 μL去離子水（65 ℃ 預(yù)熱），混勻，-20 ℃ 保存。

1.2.2.3 核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)序列的PCR擴(kuò)增及測(cè)序 PCR擴(kuò)增：以ITS1（5-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3）和ITS4（5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3）為引物，擴(kuò)增rDNA的ITS1、5.8S和ITS2區(qū)域。反應(yīng)體系含DNA模板1 μL（約10 ng），10×緩沖液（20 mmol·L-1 Tris-HCl， 20 mmol·L-1 KCl） 2.5 μL，Mg2+（25 mmol·L-1 MgCl2） 2 μL，dNTP（共10 mmol·L-1，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol·L-1） 0.2 μL，引物（ 2 μmol·L-1）各1 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH20至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性4 min，然后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min。

電泳檢測(cè)：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入1 μL 6×loading buffer，混勻，點(diǎn)樣于1.5% 的瓊脂糖凝膠（含0.05 μL·mL-1 Goldview）上樣孔中進(jìn)行電泳檢測(cè)（120 V，30 min）。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.2.4 蔓枯病菌間rDNA-ITS序列比較 將測(cè)序結(jié)果放入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，搜索同源性序列。根據(jù)這些序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已鑒定出的菌株的ITS序列相似度，從分子水平對(duì)收集的蔓枯病菌進(jìn)行鑒定與比較。將測(cè)得的rDNA-ITS序列利用DNAssist version 2.2軟件進(jìn)行比較，分析菌株之間是否存在遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對(duì)同一西瓜品種的致病力差異

調(diào)查發(fā)現(xiàn)：致病力強(qiáng)的菌株在西農(nóng)8號(hào)離體葉片上接種1 d 后葉面就出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，2 d 后發(fā)病率在 50% 以上，侵染處開(kāi)始褐化，病斑呈不規(guī)則形狀沿葉脈擴(kuò)展。4 d 后發(fā)病率高達(dá)100 %，許多相鄰病斑擴(kuò)展連成一片，而對(duì)照葉面則未發(fā)病。這表明蔓枯病菌的分生孢子可以在離體葉片上正常萌發(fā)，并引起葉片發(fā)病。離體葉片接種4 d后，葉片出現(xiàn)不同程度感染，19個(gè)蔓枯病菌菌株之間病情指數(shù)存在顯著性差異，表現(xiàn)出不同的致病力，且絕大多數(shù)蔓枯病菌株致病力居中或偏強(qiáng)。其中，WMMK-47、WMMK-10、WTMK-76、WTMK-23等菌株病情指數(shù)均較高，致病力較強(qiáng)。而LZMK-34、QXMK-69 病情指數(shù)較低，致病力弱（表1）。

2.2 不同蔓枯病菌菌株ITS序列比較分析

對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的19個(gè)菌株，采用SDS裂解法提取病原菌的總DNA，以提取到的總DNA為模板，采用特異性引物分別擴(kuò)增出了19個(gè)蔓枯病菌菌株的ITS序列。結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增片斷大小在500 bp左右。通過(guò)PCR產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)得到的19株蔓枯病菌的ITS序列長(zhǎng)度在518～533 bp（圖 1）。

通過(guò)Blast比對(duì)搜索發(fā)現(xiàn)，所測(cè)得的19條ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中子囊菌門球殼菌屬 （Didymella Sacc.）的瓜類黑腐球殼菌 Didymella bryoniae 相似度均在98% 以上。而Didymella bryoniae的無(wú)性型正是殼二孢屬西瓜殼二孢菌Ascochyta citrullina。該結(jié)果進(jìn)一步從分子角度明確了該菌的分類地位。

采用DNAsist version2.2軟件對(duì)測(cè)得的19株蔓枯病菌的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這19株真菌的ITS序列間差別不大，非常保守 （圖2）。

3 討 論

本研究采用離體葉片接種法對(duì)不同來(lái)源的19個(gè)菌株在同一西瓜品種（西農(nóng)8號(hào)）上的致病力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同菌株之間致病力有較大差異，分離獲得的絕大多數(shù)蔓枯病菌株致病力居中或偏強(qiáng)。該結(jié)果與Amand等[1]和吳海波等[2]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的差異，這可能是由于實(shí)驗(yàn)條件不同或選擇的供試品種不同造成的，也有可能是因?yàn)榇嬖诓煌纳硇》N，值得進(jìn)一步探討。

研究表明，測(cè)定分析真菌rDNA-ITS序列是進(jìn)行真菌分類鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育研究的有效方法之一[6]。目前，真菌 rDNA-ITS序列比對(duì)分析已被廣泛應(yīng)用于許多病原真菌的系統(tǒng)發(fā)生上。本研究對(duì)19株來(lái)源不同的蔓枯病菌的ITS序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這19株真菌的ITS序列間差別不大，非常保守，菌株間遺傳多樣性不明顯。雖然其中15株菌株來(lái)自南寧市郊，但BHMK-59、LZMK-34、LZMK-34和GLMK-85分別采集自北海、柳州和桂林地區(qū)，采樣地點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，但地理位置之間的差異并未體現(xiàn)在菌株的遺傳多樣性上。因此認(rèn)為，廣西地區(qū)西、甜瓜蔓枯病菌群分化和變異不明顯，整體上比較單一。

不同蔓枯病菌菌株的致病力存在差異，而又為何未表現(xiàn)在ITS序列上，這可能與所用分析方法等因素有關(guān)，也可能是由于真菌的ITS區(qū)序列保守程度高，菌株間的微小差異未表現(xiàn)在ITS區(qū)序列上，需要結(jié)合其他方法（如RAPD、AFLP等）進(jìn)一步分析菌株的變異性。對(duì)此現(xiàn)象，有待作進(jìn)一步深入研究探討。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)不同的蔓枯病菌菌株致病力存在顯著性差異，分離獲得的絕大多數(shù)蔓枯病菌株的致病力居中或偏強(qiáng)。但不論是不同地理來(lái)源和不同致病力的蔓枯病菌菌株之間的ITS序列比較差別不大，說(shuō)明其ITS區(qū)序列的保守程度高，菌株間的分化不明顯。由此可以推測(cè)，廣西地區(qū)西、甜瓜上的蔓枯病菌群體比較單一，未產(chǎn)生較大的分化和變異。西、甜瓜蔓枯病菌菌株間ITS區(qū)序列保守程度高，分析不同菌株間的變異性或差異性，需結(jié)合其他方法（如RAPD、AFLP等）進(jìn)行進(jìn)一步深入研究探討。

參考文獻(xiàn)

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