吳福勇 畢銀麗 毛艷麗

摘要：采用室內(nèi)試驗(yàn)的方法研究不同接種方式接種威廉環(huán)毛蚓（Pheretima guillelmi）、植物促生根際細(xì)菌（鉀活化細(xì)菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ ＰＤＳＫ－１）和固氮細(xì)菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ ＰＤＳＮ－５））對(duì)土壤中固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌的生長(zhǎng)、土壤脲酶的活性以及土壤鉀有效性的影響。７種接種方式均明顯增加了土壤中固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌的生長(zhǎng)。蚯蚓活動(dòng)對(duì)土壤中固氮細(xì)菌生長(zhǎng)的影響有限，但明顯增加了鉀活化細(xì)菌的生長(zhǎng)。接種蚯蚓、接種固氮細(xì)菌、接種蚯蚓和固氮細(xì)菌均明顯增加了土壤中脲酶的活性。土壤中脲酶活性和速效鉀的濃度分別與土壤中固氮細(xì)菌與鉀活化細(xì)菌的數(shù)量成顯著正相關(guān)關(guān)系（Ｐ＜０．０５）。試驗(yàn)結(jié)果表明，混合接種方式是一種有潛力的生物技術(shù)，可以用來(lái)減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥的施用量。

關(guān)鍵詞：蚯蚓；植物促生根際細(xì)菌；混合接種；土壤酶活性

中圖分類號(hào)：Ｑ９３９．１ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3186-04

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ Ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ

ｏｆ Ｎ ａｎｄ Ｋ ｉｎ Ｓｏｉｌ

ＷＵ Ｆｕ－ｙｏｎｇ１，２，ＢＩ Ｙｉｎ－ｌｉ２，ＭＡＯ Ｙａｎ－ｌｉ１

（１． Department of Environmental arol Municipal Engineering， Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｒｂａｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， Ｐｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ ４６７０３６２， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｐｏｔ ｔｒｉａｌ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ， ｄｕａｌ ｏｒ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ ｏｒ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ （ＰＧＰＲ）， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ （ＮＦＢ） （Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ ＰＤＳＮ－５） ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ （ＫＳＢ）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ ＰＤＳＫ－１）， ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＮＦＢ ａｎｄ ＫＳＢ ａｎｄ Ｎ ａｎｄ Ｋ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｓｏｉｌｓ． Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＮＦＢ ａｎｄ ＫＳＢ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍ ｈａｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＮＦＢ， ｂｕｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＫＳＢ． Ｔｈｒｅｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍ， ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦＢ ａｎｄ ｄｕａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍ ａｎｄ ＮＦＢ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｕｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｏｉｌｓ obviously． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＮＦＢ ａｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＨ４ＯＡｃ－ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ Ｋ （ｒ=０．４７， Ｐ＜０．０５） ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＫＳＢ （ｒ＝０．４４， Ｐ＜０．０５） ｉｎ ｓｏｉｌ． Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ； ＰＧＰＲ； ｍｉｘｔｕｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ； ｓｏｉｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ

蚯蚓普遍存在于溫帶和熱帶生態(tài)系統(tǒng)中，是重要的陸地生態(tài)系統(tǒng)工程師［１］。蚯蚓在促進(jìn)有機(jī)物質(zhì)分解和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)、轉(zhuǎn)化等過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。據(jù)估計(jì)，通過(guò)排泄及分泌黏液，蚯蚓大約每年向每平方米土壤提供３．４～４．１ ｇ的礦化氮［２］。此外，土壤中廣泛存在的植物促生根際細(xì)菌（包括固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌）也能夠明顯增加土壤營(yíng)養(yǎng)元素的可利用性，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)［３，４］。蚯蚓可以通過(guò)直接取食、攜帶傳播微生物等方式影響土壤微生物群落的數(shù)量、活性、組成和功能，因此，蚯蚓與微生物交互作用是土壤生態(tài)學(xué)研究的一個(gè)重點(diǎn)。Ｐａｒｌｅ［５］研究表明，土壤通過(guò)蚯蚓腸道后，細(xì)菌、放線菌的數(shù)目有大幅度的增加，而真菌的數(shù)目無(wú)變化。然而，蚯蚓活動(dòng)對(duì)土壤中固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌生長(zhǎng)的影響目前尚不清楚。

土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的濃度通常受土壤中有關(guān)酶活性的影響。土壤微生物和植物的根均能夠產(chǎn)生該類酶。當(dāng)土壤中可利用的營(yíng)養(yǎng)元素降低時(shí)，土壤微生物或植物均能夠增加這些酶的分泌，從而促進(jìn)無(wú)機(jī)氮和磷的供應(yīng)。土壤脲酶普遍存在于土壤中，是由細(xì)菌分泌的一種酶，并在氮素轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用，能分解有機(jī)氮化合物，為植物提供氮素營(yíng)養(yǎng)［６］。徐曉燕等［７］研究表明，蚯蚓活動(dòng)能夠增加農(nóng)田土壤中脲酶的活性。然而，同時(shí)接種蚯蚓與植物促生根際細(xì)菌對(duì)土壤中脲酶的活性及營(yíng)養(yǎng)元素可利用性的影響尚不清楚。本研究通過(guò)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)了解蚯蚓活動(dòng)對(duì)土壤中固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，研究接種蚯蚓、固氮細(xì)菌、鉀活化細(xì)菌分別對(duì)土壤脲酶的活性影響以及對(duì)土壤中鉀有效性的影響，研究結(jié)果將為增加土壤肥力，減少農(nóng)田化肥施用量、改善農(nóng)田環(huán)境奠定一定的理論基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

試驗(yàn)用蚯蚓為威廉環(huán)毛蚓（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｇｕｉｌｌｅｌｍｉ）采集于河南平頂山郊區(qū)菜田，并在室內(nèi)培養(yǎng)３周。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)前，為最大程度減少蚯蚓體表及消化道內(nèi)細(xì)菌對(duì)試驗(yàn)的影響，蚯蚓放置在滅菌玻璃瓶（直徑１２ ｃｍ、高１４ ｃｍ）內(nèi)餓食２４ ｈ。所有供試蚯蚓為成年蚯蚓，鮮體重約為１．５ ｇ。試驗(yàn)用固氮細(xì)菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ ＰＤＳＮ－５）及鉀活化細(xì)菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ ＰＤＳＫ－１）均采集于河南平頂山郊區(qū)菜田，分離及培養(yǎng)按照參考文獻(xiàn)［８］的方法進(jìn)行。培養(yǎng)后的２種細(xì)菌分別轉(zhuǎn)移至經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌（１２１ ℃， ２０ ｍｉｎ）的草炭（直徑２ ｍｍ），４ °Ｃ保存待用。該混合物將做為微生物接種劑，草炭中的固氮細(xì)菌及鉀活化細(xì)菌種群密度分別為５．０×１０９ 和 ４．０×１０９ ＣＦＵ／ｋｇ （干重）。 供試土壤采集于河南平頂山郊區(qū)菜田（０～１０ ｃｍ表層土），理化性狀如表１所示。土壤在裝盆前過(guò)篩（直徑＜２ ｍｍ）、高溫高壓蒸汽滅菌（１２１℃， ２ ｈ）， 風(fēng)干備用。

１．２方法

１．２．１試驗(yàn)設(shè)計(jì)室內(nèi)試驗(yàn)采用如下８種處理：接種蚯蚓、接種固氮細(xì)菌、接種鉀活化細(xì)菌、接種蚯蚓＋鉀活化細(xì)菌、接種鉀活化細(xì)菌＋固氮細(xì)菌、接種蚯蚓＋鉀活化細(xì)菌＋固氮細(xì)菌以及對(duì)照處理（不接種蚯蚓及植物促生根際細(xì)菌），每處理設(shè)３個(gè)重復(fù)。

１．２．２接種方法每盆（１２ ｃｍ×１３ ｃｍ，高×直徑）裝風(fēng)干土壤１．５ ｋｇ，每盆添加３個(gè)大小基本一致的蚯蚓作為接種蚯蚓處理，為防止蚯蚓逃逸，土層表面覆蓋塑料膜。每盆接種植物促生根際細(xì)菌（備用草炭）５ ｇ，對(duì)照及接種蚯蚓處理組分別加入相應(yīng)的５ ｇ滅菌菌劑和２５ ｍＬ菌劑濾液，以保持土壤中除植物促生根際細(xì)菌外其他微生物區(qū)系的一致性。

１．２．３試驗(yàn)管理試驗(yàn)于日光溫室（２８ ℃（晝）／２３ ℃（夜））中進(jìn)行，每３天澆１次去離子水，維持土壤含水量在最大持水量的６０％。３０ ｄ后每盆隨機(jī)采集５０ ｇ土壤樣品， 一半新鮮土樣用來(lái)測(cè)定土壤脲酶、活體固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌，一半風(fēng)干待用。

１．２．４樣品分析土壤中Ｎ、Ｐ、Ｋ含量采用常規(guī)方法測(cè)定。液土比５∶１測(cè)定土壤ｐＨ、ＥＣ，試驗(yàn)用水為無(wú)ＣＯ２去離子水。按照參考文獻(xiàn)［９］的方法測(cè)定土壤中活體固氮細(xì)菌和活體鉀活化細(xì)菌的菌落形成單位。土壤脲酶活性測(cè)試采用靛酚比色法［１０］，以尿素為反應(yīng)基質(zhì)，經(jīng)土壤脲酶酶促水解反應(yīng)后生成氨，氨與酚類化合物起反應(yīng)生成藍(lán)色的靛酚，顏色深度與氨含量相關(guān)。脲酶活性以１ ｇ 土壤在３７ ℃下培養(yǎng)２ ｈ釋放出ＮＨ３－Ｎ的微克數(shù)表示。

１．２．５統(tǒng)計(jì)分析對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果采用ＳＡＳ ８．１軟件利用最小顯著法進(jìn)行方差分析，所有處理均在０．０５水平下進(jìn)行顯著性分析。

２結(jié)果與分析

２．１接種蚯蚓及植物促生根際細(xì)菌對(duì)土壤中固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

接種蚯蚓及植物促生根際細(xì)菌明顯增加了土壤中固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌的生長(zhǎng)（圖１）。接種蚯蚓、接種固氮細(xì)菌、接種蚯蚓＋固氮細(xì)菌、接種固氮細(xì)菌＋鉀活化細(xì)菌和混合接種的土壤中固氮細(xì)菌的數(shù)量分別為對(duì)照的５．４、２０．７、１５．２、１９．３、１６．５倍（圖１ａ）。接種蚯蚓＋固氮細(xì)菌處理與接種蚯蚓、接種固氮細(xì)菌處理相比，土壤中固氮細(xì)菌數(shù)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?；旌辖臃N處理與接種固氮細(xì)菌＋鉀活化細(xì)菌處理相比，土壤中固氮細(xì)菌數(shù)量也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說(shuō)明蚯蚓活動(dòng)對(duì)土壤中固氮細(xì)菌生長(zhǎng)的影響有限。另外，接種蚯蚓、接種鉀活化細(xì)菌、接種蚯蚓＋鉀活化細(xì)菌、接種固氮細(xì)菌＋鉀活化細(xì)菌、混合接種的土壤中鉀活化細(xì)菌的數(shù)量分別為對(duì)照的５．０、９．７、１２．１、８．５、１８．３倍（圖１ｂ）?；旌辖臃N處理下土壤中鉀活化細(xì)菌數(shù)量顯著多于接種鉀活化細(xì)菌＋固氮細(xì)菌處理（Ｐ＜０．０５），接種蚯蚓＋鉀活化細(xì)菌處理分別與接種蚯蚓及接種鉀活化細(xì)菌處理相比土壤中鉀活化細(xì)菌數(shù)量也有增加的趨勢(shì)，表明蚯蚓活動(dòng)明顯增加了土壤中鉀活化細(xì)菌的生長(zhǎng)。

２．２接種蚯蚓及植物促生根際細(xì)菌對(duì)土壤中脲酶活性和速效鉀濃度的影響

接種蚯蚓及植物促生根際細(xì)菌對(duì)土壤中脲酶活性和速效鉀濃度的影響見(jiàn)圖２。接種蚯蚓、接種固氮細(xì)菌、接種蚯蚓＋固氮細(xì)菌均明顯增加了土壤中脲酶的活性，其中后兩種接種方式與對(duì)照相比較，差異均達(dá)到顯著水平（Ｐ＜０．０５）。接種蚯蚓對(duì)土壤中速效鉀濃度的影響不大，但是，接種鉀活化細(xì)菌及接種蚯蚓＋鉀活化細(xì)菌明顯增加了土壤中速效鉀濃度。接種蚯蚓＋鉀活化細(xì)菌處理中速效鉀濃度是對(duì)照的２．１倍，與對(duì)照相比達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平（Ｐ＜ ０．０５）。此外，土壤中脲酶活性和速效鉀的濃度分別與土壤中固氮細(xì)菌與鉀活化細(xì)菌成顯著正相關(guān)關(guān)系（ｒ＝０．４７，Ｐ＜０．０５；ｒ＝０．４４，Ｐ＜０．０５）（表２）。

３討論

蚯蚓和微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，它們的存在提高了土壤容納和供給生物所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力［１１］。蚯蚓活動(dòng)能夠影響土壤生態(tài)系統(tǒng)中其他微生物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蚯蚓對(duì)土壤中固氮細(xì)菌的生長(zhǎng)影響不大，但對(duì)鉀活化細(xì)菌生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用。徐曉燕等［１２］的研究結(jié)果顯示：無(wú)論是接種人工培養(yǎng)的蚯蚓或是接種野生的蚯蚓，均會(huì)導(dǎo)致土壤中微生物類群的數(shù)量有不同程度的增加，其中細(xì)菌數(shù)量的增加比放線菌和真菌的增加明顯。Ｚｈａｎｇ等［１３］研究表明，經(jīng)蚯蚓過(guò)腹轉(zhuǎn)化的土壤更有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而進(jìn)一步增加微生物數(shù)量與活性。蚯蚓活動(dòng)對(duì)鉀活化細(xì)菌的促生作用機(jī)理需更深入更系統(tǒng)的研究。此外，單接種蚯蚓處理土壤中的固氮細(xì)菌及鉀活化細(xì)菌可能來(lái)自于蚯蚓自身肛腸內(nèi)。

接種蚯蚓、固氮細(xì)菌和鉀活化細(xì)菌顯著增加了根際土壤中脲酶的活性及速效鉀的濃度。土壤酶活性與土壤微生物活動(dòng)有很強(qiáng)的相關(guān)性［１４］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，土壤中脲酶的活性與土壤中的固氮細(xì)菌的數(shù)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。此外，蚯蚓也可以通過(guò)排糞、作穴、攪動(dòng)等活動(dòng)來(lái)改善土壤的營(yíng)養(yǎng)狀況。徐曉燕等［７］研究表明，當(dāng)接種毛利環(huán)毛蚓的數(shù)量增加１倍后，土壤脲酶活性增加了５９．３％。劉賓等［１５］認(rèn)為在紅壤中接種蚯蚓可以顯著提高土壤中銨態(tài)氮的含量。與對(duì)照相比，接種蚯蚓＋鉀活化細(xì)菌造成鉀活化細(xì)菌顯著增加，從而造成土壤中速效鉀濃度的顯著升高。鉀活化細(xì)菌能夠產(chǎn)生有機(jī)酸，這些有機(jī)酸能夠改變硅酸鹽的組成結(jié)構(gòu)，進(jìn)而向土壤中釋放可利用態(tài)鉀。Ｆａｌｌａｈ等［１６］研究表明，鉀活化細(xì)菌存在時(shí)，可以導(dǎo)致土壤中多釋放出１６％～４０％的可利用態(tài)鉀。綜上所述，本研究結(jié)果表明，混合接種方式是一種有潛力的生物技術(shù)，可以用來(lái)減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的化肥施用量，特別是對(duì)大范圍的依賴有機(jī)物分解釋放養(yǎng)分的有機(jī)農(nóng)業(yè)尤為重要。

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