叢倩倩　許斐斐　李向東　張廣民

摘 要：利用RT-PCR對2012年山東10個地區(qū)送檢的105個小麥樣品進行了檢測，從泰安、臨沂、棗莊3個地區(qū)的樣品中檢測到了小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）。這3個地區(qū)WYMV分離物CP基因的核苷酸一致率為976%～983%，氨基酸一致率為983%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中，這3個分離物均與WYMV分離物聚類到一起，其中棗莊分離物和河南分離物（FR828007）親緣關系更近。

關鍵詞：小麥黃花葉病毒；CP基因；系統(tǒng)進化分析

中圖分類號：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2012）11-0008-04

Molecular Detection and Identification of Wheat Yellow Mosaic Virus

in Shandong Province

Cong QianQian， Xu FeiFei， Li XiangDong*， Zhang GuangMin

（Department of Plant Pathology， College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

Abstract One hundred and five wheat samples collected from 10 districts of Shandong Province were detected for wheat yellow mosaic virus （WYMV） using RT-PCR. WYMV was detected from samples from Taian， Linyi and Zaozhuang. The coat protein genes of WYMV from these three areas shared the nucleotide identity of 97.6%～98.3% and the amino acid identity of 98.3%～99.0%. In the phylogenetic tree constructed based on the nucleotide sequence， the three isolates were clustered together with other WYMV isolates. The isolates from Zaozhuang had closer genetic relationships with the isolate from Henan.

Key words Wheat yellow mosaic virus； CP gene； Phylogenetic analysis

禾谷多黏菌（Polymyxa graminis L）是一種專性寄生于禾本科植物根部的低等真核生物，可以傳播多種植物病毒，導致產(chǎn)量嚴重損失[1]。禾谷多黏菌傳播的小麥病毒有小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）、中國小麥花葉病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）、小麥梭條斑花葉病毒（Wheat spindle streak mosaic virus，WSSMV）和土傳小麥花葉病毒（Soil-borne wheat mosaic virus，SBWMV）等[2]。

2012年，在山東部分地區(qū)的冬小麥上發(fā)現(xiàn)了一種由禾谷多黏菌傳播的病毒病，感病小麥植株表現(xiàn)矮化和黃化花葉等癥狀。本研究利用RT-PCR的方法，對山東10個地區(qū)送檢的疑似小麥黃花葉病毒病的樣品進行了檢測，并對部分病毒分離物的外殼蛋白（CP）基因進行測序分析。

1 材料與方法

11 材料與試劑

疑似病毒病的小麥樣品由泰安、臨沂、青島、煙臺、德州、淄博、菏澤、棗莊、日照和威海等10個地市植保站提供，共105個樣品。

試驗所用TransZol購自TransGen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TransGen公司；RCR試劑、T4連接酶和pMD18-T克隆載體購自大連寶生物公司；回收試劑盒購自TransGen公司；其它化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

12 試驗方法

121 植物總RNA的提取 參照TransZol試劑盒的（TransGen公司）說明，從新鮮的植物材料中提取總RNA。稱取 02 g 樣品于干熱滅菌的研缽中加液氮研磨，加1 ml TransZol 劇烈振蕩，靜置5 min，加入200 μl氯仿劇烈振蕩15 s，放置3 min，12 000 r/min離心15 min。取上清，加入500 μl異丙醇，12 000 r/min離心10 min。用 75% 乙醇洗滌沉淀，8 000 r/min離心5 min。室溫晾干沉淀，加入50 μl溶解液溶解沉淀，-80℃保存。

122 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR） 根據(jù)已報道的WYMV、CWMV、BaYMV（大麥黃花葉病毒）、BaMMV（大麥和性花葉病毒）、WSSMV、SBWMV序列設計針對外殼蛋白編碼區(qū)具有特異性的檢測引物（表1）。以提取的總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，反應體系為20 μl。向不含RNA酶的02 ml離心管中加入 RNA 8 μl（約2 μg），10 μmol/L 反向引物（R端）1μl，2×TS Buffer 10 μl和TS Mix（含有M- mlV反轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑）1 μl。反轉(zhuǎn)錄程序為：42℃ 50 min；85℃ 5 min。

表1 本研究所用的檢測引物引物名稱 引物序列 擴增片段

長度（bp） 退火溫

度（℃）

WYMV-F[3] 5′-GAGCTCATGGCAGCTGAC-3′ 905 55

WYMV-R 5′-AGGGGAGTACTGGTTTAGGTTAGT-3′

CWMV-F[4] 5′-ACATATGGCCGTGAAATCTGG-3′ 510 58

CWMV-R 5′-TGGATCCTCAACTCGAACCTTCCC-3′

BaYMV-F[5] 5′-CACGCGTTGTCACTCTACAA-3′ 803 56

BaYMV-R 5′-GGTCACCTTCTTACGCCTTT-3′

WSSMV-F[3] 5′-CGAGTACTGTATGCATTACGGTGGTTGTGA-3′ 1013 60

WSSMV-R 5′-CGAGTACTGATACAGATATACGACCAC-3′

SBWMV-F[6] 5′-TTTAAGCTATGGGCTAGTATGTTTAATTATAAGGG-3′ 1552 57

SBWMV-R 5′-CGGGGGGGATTTGAAC-3′

BaMMV-F[7] 5′-GATAGCCTTGTTGCACTACG-3′ 1135 52

BaMMV-R 5′-AACCTTTCCGGTATACA-3′

PCR 反應采用25 μl體系。含ddH2O 152 μl，10×PCR緩沖液 25 μl，dNTPs（每種25mmol/L）1 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物25 μl，10 μmol/L的正向（F端）和反向（R端）引物各1 μl，25 mmol/L MgCl2 15 μl，5 U/μl Taq DNA聚合酶 03 μl。反應條件為 ：94℃ 預變性5 min；然后94℃，30 s，每對檢測引物的退火溫度如表1，45 s，72℃，延伸時間按照1 kb/min，33個循環(huán)；最后 72℃ 終延伸10 min。

123 目的片段的回收、克隆及分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的低熔點瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，用北京全式金公司的膠回收試劑盒回收目的片段?；厥掌闻c pMD18-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞。37℃ 培養(yǎng)14～16 h，挑取單菌落培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，PCR鑒定篩選重組質(zhì)粒。含外源片段的重組質(zhì)粒送上海博尚生物技術(shù)有限公司測序。

利用MegAlign軟件比較所得序列與GenBank中WYMV CP基因序列的一致率，利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以大麥黃花葉病毒（Barley yellow mosaic virus，BaYMV）的CP基因為外組，保留Bootstrap值大于50%的分支。2 結(jié)果與分析

21 樣品檢測結(jié)果

在105個樣品中，利用引物WYMV-F和WYMV-R從泰安8個樣品、臨沂和棗莊各6個樣品中擴增到約900 bp的片段，和預期大小一致。這些樣品中不含其它病毒。其它樣品中未檢測到WYMV，也未檢測到CWMV、BaYMV、BaMMV、WSSMV、SBWMV中的任何一種病毒。

22 WYMV CP基因序列測定及一致率分析

將從泰安、臨沂和棗莊3個地區(qū)樣品中擴增到的WYMV片段進行克隆和測序分析，證明擴增的片段包括905個核苷酸，其中CP基因882個核苷酸，編碼293個氨基酸。

棗莊和臨沂分離物CP基因的核苷酸和氨基酸一致率分別為976%和990%，棗莊和泰安分離物的核苷酸和氨基酸一致率分別為983%和990%，泰安和臨沂分離物的核苷酸和氨基酸一致率分別為982%和983%。棗莊分離物與GenBank中其它WYMV分離物CP基因的核苷酸和氨基酸一致率分別為972%～993%和969%～997%，臨沂分離物與GenBank中其它WYMV分離物CP基因的核苷酸和氨基酸一致率分別為972%～984%和969%～990%，泰安分離物與GenBank中其它WYMV分離物CP基因的核苷酸和氨基酸一致率分別為976%～994%和976%～997%。

23 系統(tǒng)發(fā)育關系分析

以BaYMV兩個分離物（AJ224623，AJ224624）的CP基因為外組，根據(jù)泰安（TA）、臨沂（LY）和棗莊（ZZ）3個分離物及GenBank上WYMV分離物的CP基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖1）。結(jié)果表明，泰安（TA）、臨沂（LY）和棗莊（ZZ）3個分離物與其它WYMV分離物聚類到一起，形成許多與地理來源無關的姊妹分支。其中棗莊分離物（ZZ）與湖北羅田、武漢以及河南的分離物聚為一簇，并與河南分離物（FR828007）形成一個小的分支，說明二者之間的親緣關系最近。

本研究利用RT-PCR的方法對山東10個地區(qū)疑似黃花葉病毒病的小麥樣品進行了檢測，結(jié)果只檢測到了WYMV，表明WYMV是引起山東小麥黃花葉病的主要病毒。

本研究只從20個疑似黃花葉樣品中檢測到了WYMV，可能與WYMV的發(fā)生特點和取樣時間有關。WYMV在20℃以上會隱癥。樣品送檢的時間在4月底，此時氣溫已經(jīng)較高，影響了對癥狀的判斷。據(jù)報道，煙臺、威海、青島、臨沂、濰坊和濟寧等地也有禾谷多黏菌傳小麥病毒病的發(fā)生，其中榮成市不夜村和黎明村、文登市、青島市嶗山區(qū)等地還有CWMV的發(fā)生[8～11]，而且CWMV和WYMV的發(fā)生面積和程度在不斷變化中[12]。小麥上是否還有其他病毒的發(fā)生還需要加強檢測和研究。

WYMV CP基因聚類結(jié)果表現(xiàn)出姊妹分支，說明這些分離物的CP基因序列一致率較高。需要加強對不同地區(qū)WYMV來源的研究，這對有效控制病害發(fā)生具有重要作用。參 考 文 獻：

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