范建芝　井水華　楊淑娟　段成鼎　黃成星

摘 要：低溫療法是近幾年剛剛興起的一種新的脫除植物病毒的方法。本文從低溫療法脫除植物病毒的原理、方法、步驟及應(yīng)用情況等方面進(jìn)行了綜述，旨在為該方法的推廣應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：低溫療法；超低溫保存；植物病毒；脫毒

中圖分類號：S474+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2012）11-0106-06

Research Progress of Cryotherapy on Plant Virus Eradication

Fan JianZhi， Jing ShuiHua， Yang ShuJuan， Duan ChengDing， Huang ChengXing*

（Jining Academy of Agricultural Sciences， Jining 272131， China）

Abstract Cryotherapy is a new plant virus eradication method developed in recent years. In this paper， the cryotherapy principle， methods， procedures and application status were summarized in order to provide reference for further application.

Key words Cryotherapy； Cryopreservation； Plant virus； Virus eradication；

植物病毒是危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最大的病害之一，有“植物癌癥”之稱，到目前為止尚未有很有效的防治方法[1]，其中生產(chǎn)和保持無病毒植株材料至關(guān)重要[2～4]。傳統(tǒng)的植物脫毒方法主要有莖尖培養(yǎng)脫毒法、熱處理脫毒法和熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒法等。熱處理脫毒法操作容易，但費(fèi)時，脫毒不完全，植株存活率低；莖尖培養(yǎng)脫毒法脫毒率較高，但需在解剖鏡下切取01～05 mm莖尖，操作和培養(yǎng)困難；熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒法比單純的熱處理和莖尖培養(yǎng)的脫毒率和植株成活率高，是目前去除植物病毒較有效的方法[5， 6]。

低溫療法（Cryotheraphy）是近年興起的一種基于超低溫保存（Cryopreservation）新的種苗脫毒方法，可同步實(shí)現(xiàn)優(yōu)良種質(zhì)資源離體快繁、脫毒和中長期保存目標(biāo)。其原理是：含有病毒的頂端細(xì)胞液泡較大，胞液中含有較多的水分，在超低溫（-80℃以下）保存過程中易形成冰晶致死；而增殖速度較快的分生組織胞質(zhì)濃，含水量少，抗凍性強(qiáng)，液氮保存后可獲得無病毒再生植株[7]。目前該項(xiàng)技術(shù)已成功用于果樹蘋果（Malus domestica）潛隱性病毒、李屬（Prunus）李痘病毒、香蕉（Musa paradisiaca var sapientum）條斑病毒（BSV）和黃瓜花葉病毒（CMV）、葡萄（Vitis vinifera）病毒GVA、馬鈴薯（Solanum tuberosum）PSTVd和PVX病毒、草莓（Fragaria ananassa）輕型黃邊病毒（SMYEV）等。

低溫療法優(yōu)點(diǎn)：易于操作，存活率、再生率和脫毒率高，短時間內(nèi)就可以生產(chǎn)出無病毒植株。低溫療法主要步驟：

準(zhǔn)備帶病毒植物材料—→剝離莖尖—→莖尖預(yù)處理—→組織細(xì)胞脫水處理

—→液氮處理—→莖尖再培養(yǎng)及植株再生—→再生植株病毒檢測

1 常見的低溫療法研究現(xiàn)狀

目前常用于低溫療法的超低溫保存方法主要有玻璃化法（Vitrification）、包埋玻璃化法（Encapsulation-vitrification）和微滴玻璃化法（Droplet-vitrification），其中應(yīng)用最多的是玻璃化法。

11 玻璃化法超低溫保存

玻璃化法超低溫保存是將細(xì)胞或組織置于由一定比例的滲透性和非滲透性保護(hù)劑組成的玻璃化溶液（Plant Vitrification Solutions，PVS）中，使細(xì)胞及其玻璃化溶液在足夠快的降溫速率下過冷至玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Glassy transition temperature，Tg），從而被固化成玻璃化態(tài)（非晶態(tài)），并以這種玻璃化態(tài)在低溫下保存[8]。玻璃化法超低溫保存包括以下8個步驟：（1）保存材料適宜類型和狀態(tài)的篩選；（2）預(yù)培養(yǎng)（Preculture）；（3）裝載（Loading）；（4）玻璃化溶液脫水（Dehydration with PVS）；（5）投入液氮保存；（6）保存后快速化凍（Rapid warming）；（7）去除玻璃化液（De-vitrification）；（8）保存材料的活性檢測和恢復(fù)培養(yǎng)（Activity assay and Recovery）。玻璃化法因操作簡單快捷，適宜保存種類廣泛，保存效果好，是近十年來用于優(yōu)良種質(zhì)資源中長期保存的首選方法[9]。

圖1 玻璃化法脫毒步驟[9]

與傳統(tǒng)的超低溫保存方法相比，玻璃化法以其要求設(shè)備簡單、材料處理步驟簡便、省時省力、效果和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)備受人們推崇，成為較為理想的植物種質(zhì)資源保存方法[10]。

Brison 等（ 1997）[11]用超低溫保存結(jié)合莖尖離體培養(yǎng)，成功地去除了李屬根狀莖上的李痘病毒，脫毒率達(dá)50%（莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒率只有20%），開創(chuàng)了超低溫脫毒的方法。他們以感染李痘病毒（Plum pox potyvirus，PPV）的櫻桃砧木莖尖為試驗(yàn)材料，采用玻璃化法對PPV脫除進(jìn)行了研究，先將莖尖在富含5% DMSO和2% 脯氨酸的分生組織培養(yǎng)基（MS）上培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)移到改良后的PVS2冷凍保護(hù)混合液中20～40 min。冷凍管以1℃/min的冷凍速率冷凍至-40℃，然后浸入到液氮中。第二天，通過快速加溫，使樣品在40℃融化1min，用含有12 mol/L蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基沖洗，并放在分生組織培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

Helliot等（2002）[12]通過超低溫保存玻璃化法分別除去了香蕉中的黃瓜花葉病毒（CMV）和香蕉條紋病毒（BSV），兩種病毒的脫除率分別為30%和90%，而傳統(tǒng)的莖尖分生組織培養(yǎng)對CMV和BSV的脫除率僅為0和76%。

王壯偉（2003）[13]用熱處理+莖尖培養(yǎng)、熱處理+莖尖培養(yǎng)+板藍(lán)根、超低溫玻璃化法+莖尖培養(yǎng)3種方法對蘋果潛隱性病毒進(jìn)行了脫除，其中超低溫玻璃化法+莖尖培養(yǎng)法脫除蘋果病毒效果最好，脫毒率可達(dá)70%。

蔡斌華等（2008）[14]用2 mm草莓莖尖為試驗(yàn)材料，通過玻璃化超低溫處理脫除了草莓輕型黃邊病毒（SMYEV），草莓莖尖的存活率為76%，SMYEV脫除率為95%。

曾繼吾等（2009）[15]采用玻璃化法超低溫保存技術(shù)保存帶有BBTV（香蕉束頂病毒）的香蕉莖尖（10～15mm）， 再生后植株BBTV脫除率達(dá)606%， 而常規(guī)的莖尖培養(yǎng)對BBTV 的脫除率僅為267%。

白建明等（2010）[16]嘗試用低溫療法和3種常規(guī)方法來去除馬鈴薯試管苗中的PSTVd（馬鈴薯紡錘塊莖類病毒）和PVX（馬鈴薯X病毒），結(jié)果顯示：4 種方法都可以去除PVX，但低溫療法對PVX的去除率最高，為5913%；3種常規(guī)方法對PVX的去除率為3583%～5602%。4 種方法都未能有效地去除PSTVd 類病毒，只能通過嚴(yán)格檢疫來控制。

王子成等（2011）[17]采用玻璃化法超低溫保存對馬鈴薯病毒PVY（馬鈴薯Y病毒）和PVS（馬鈴薯S病毒）進(jìn)行了脫除研究，結(jié)果顯示：莖尖（2～3 mm）經(jīng)過超低溫保存后，材料存活率可達(dá)716%，比傳統(tǒng)的莖尖培養(yǎng)脫毒材料成活率在52%左右高；超低溫保存后PVY病毒脫除率達(dá)83%，比傳統(tǒng)脫毒方法脫毒率（62%）和熱處理脫毒率（65%）要高，且操作也較簡單；對于馬鈴薯PVS病毒脫除率在47%左右，而采用莖尖培養(yǎng)病毒的脫除率僅有17%左右。

12 包埋脫水法、包埋玻璃化法超低溫保存

包埋脫水法是先將莖尖用藻酸鹽溶液包裹，接著在富含蔗糖的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，再用無菌空氣流或干燥硅膠干燥，然后投入液氮保存。超低溫保存的莖尖用快凍法或慢凍法化凍后，接著放在再培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)和植株再生[18～21]。因?yàn)橥庵搀w的高度干燥，細(xì)胞內(nèi)多數(shù)或者全部的自由水都能夠被移除，而且在液氮中快速冷凍，內(nèi)部溶液就會發(fā)生玻璃化，因此避免了細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成[21，22]。

相對玻璃化法而言，包埋脫水法的優(yōu)點(diǎn)在于避免使用二甲亞砜和乙二醇等對細(xì)胞有毒性的冰凍保護(hù)劑；其次降溫過程也比較隨意，保存的樣品體積也可以比較大。但是，用包埋脫水法保存組織恢復(fù)生長慢，脫水所需時間長，而且在一些植物中存活率、成苗率低[23]。

包埋玻璃化法是Tannoury（1991）在超低溫保存康乃馨莖尖時形成的一種用藻酸鹽包裹和PVS2玻璃化溶液結(jié)合的方法[24]。先用藻酸鹽將莖尖包裹成球，然后將其放在富含蔗糖的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，用滲透保護(hù)溶液裝載，接著用玻璃化溶液脫水，再直接投入液氮?；瘍龊?，超低溫保存的莖尖用卸載溶液處理除去玻璃化溶液，然后對莖尖進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)，獲得再生植株[9，25]。

包埋玻璃化法對材料的玻璃化處理時間范圍要求較寬，且包埋球能降低玻璃化液對莖尖的傷害。因此，包埋玻璃化法比玻璃化法操作更方便，并可同批次處理大量材料[26]。

Wang 等（2003）[27]利用玻璃化法和包埋脫水法脫除了葡萄中的葡萄病毒A（GVA），均獲得了97%的無病毒植株，而單一的分生組織培養(yǎng)脫毒率僅為12%。而且超低溫保存的莖尖大小在05～20 mm之間時，病毒的脫除率不受莖尖大小的影響。Wang 等（2006）[18]又用包埋玻璃化法、包埋脫水法進(jìn)行了脫除馬鈴薯PLRV（馬鈴薯卷葉病毒）和PVY病毒的研究，均獲得了無病毒植株。其中包埋玻璃化法對兩種病毒的脫除率分別為83%和93%，包埋脫水法對兩種病毒的脫除率分別為85%和91%。

Wang 等（2008）[28]又對05～15 mm 大?。ê?～4個葉原基）的甘薯莖尖進(jìn)行了包埋玻璃化法超低溫保存處理， 結(jié)果所有再生的材料均脫除了甘薯黃萎病毒（sweet potato chlorotic stunt virus， SPCSV）和甘薯羽狀斑點(diǎn)病毒（sweet potato feathery mottle virus， SPFMV）， 而單一的莖尖培養(yǎng)僅能夠脫除SPCSV，SPFMV的脫除率僅為7%～10%。同時，又采用熱療法和包埋玻璃化法相結(jié)合的方法對覆盆子木霉病毒RBDV（raspberry bushy dwarf virus，）進(jìn)行了脫除研究，所用莖尖大小1 mm，病毒脫除率為33%～35%。該病毒可以通過授粉進(jìn)行傳播，且傳統(tǒng)的莖尖培養(yǎng)不能將其脫除[29]。

13 微滴玻璃化法超低溫保存

微滴法是在超低溫保存木薯（ Manihot esculenta）的莖尖分生組織過程中首先創(chuàng)造出來的。方法是先把低溫保護(hù)劑滴到鋁箔條上形成2～3 μl的微滴，然后把待保存材料放置到微滴之中，把鋁箔連同微滴一起送入程序降溫儀的冷凍室，按一定的速度降溫到-20～40℃，然后投入液氮中。因?yàn)楸砻鎻埩Φ淖饔?，操作過程中微滴并不會從鋁箔條上滑落。該方法的主要優(yōu)點(diǎn)是使用極少量的低溫保護(hù)劑，并利用鋁箔良好的導(dǎo)熱性能，以提高待保存材料降/升溫的均勻一致，減少因?yàn)椴牧辖禍厮俣炔痪鶆蚨斐傻膫30]。

微滴玻璃化法是結(jié)合了玻璃化法和微滴法的技術(shù)，莖尖先用滲透劑預(yù)培養(yǎng)，用裝載溶液裝載，用PVS2脫水，然后單個放到鋁箔片上的玻璃化溶液微滴中（4～15 μl PVS2），再投入液氮快速冷凍，接著將超低溫保存的莖尖立即化凍，并放在富含蔗糖的液體培養(yǎng)基中卸載。然后放在培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)和植株再生[9，19， 20， 25]。

Wang 等（2006）[18]用微滴玻璃化法脫除馬鈴薯PLRV和PVY病毒，兩種病毒的脫除率分別為86%和95%。

2 低溫療法脫除病毒的細(xì)胞學(xué)機(jī)制

為了弄清楚超低溫保存脫除病毒的機(jī)制，Helliot等（2002）[12]用光學(xué)顯微鏡對比觀察了香蕉莖尖分生組織（對照）和超低溫保存后快速增殖的分生組織結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)超低溫保存方法僅允許位于分生組織頂端和葉原基基部小區(qū)域的細(xì)胞存活。植物莖尖細(xì)胞組成是異質(zhì)性的， 其中包括有分化的細(xì)胞和未分化的細(xì)胞。在超低溫保存過程中， 分化的成熟細(xì)胞由于液泡較大并且含水量較多， 在超低溫處理時不容易脫水， 因而易被形成的冰晶破壞致死；而未分化的細(xì)胞由于液泡較小或不含液泡， 所以含水量少、胞質(zhì)濃， 在超低溫保存后易于成活[31]。這些小區(qū)域存活的細(xì)胞保持著活躍的細(xì)胞分裂和組織結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致再生出完整植株。被損壞的細(xì)胞位置表明冷凍損傷一般是和增多的液泡有關(guān)。實(shí)際上，冰凍損傷主要是由于細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶的結(jié)果，而這種水結(jié)晶發(fā)生在冷處理或者是熱處理步驟當(dāng)中。因此，在冷凍療法和分生組織培養(yǎng)之間主要的區(qū)別在于存活的分生組織細(xì)胞層的數(shù)量[12]。

對于感染病毒的植物， 其未分化的分生組織細(xì)胞一般不含病毒[31]。Wang（2008）將Karyeija等的組織化學(xué)的免疫定位法用于脫除甘薯SPFMV和SPCSV的研究中。在單一感染SPFMV和復(fù)合感染SPFMV和SPCSV的植物體中，SPFMV在第5和第4葉原基中被發(fā)現(xiàn)，在第1、2、3葉原基和生長點(diǎn)中沒有被發(fā)現(xiàn)。然而，在單一感染SPCSV和復(fù)合感染SPFMV 和 SPCSV的植物體中，SPCSV僅在第5葉原基中觀察到，而在第1～4葉原基和生長點(diǎn)中均未發(fā)現(xiàn)[28，32]。

在分生組織穹頂和最原始的1、2葉原基中的細(xì)胞尺寸是小的，含有小的液泡和高的核質(zhì)比率[28，29]。相比而言，分生組織基部和3、4葉原基的細(xì)胞較大，含有大的液泡和小的核質(zhì)比率。這些結(jié)果和在芭蕉（屬）莖尖上的研究結(jié)果一致[33]。經(jīng)過低溫療法后，存活的細(xì)胞僅在生長點(diǎn)和最原始的1、2原基中觀察到，在生長點(diǎn)基部的部分細(xì)胞、第3葉原基和其它較老組織的細(xì)胞均被殺死。這種存活模式已經(jīng)在各種各樣的植物種類中觀察到，比如香蕉（Musa spp）[12，33，34]，巧克力秋英（巧克力波斯菊，Cosmos atrosanguineus）[34]，覆盆子（Rubus idaeus）[36]和馬鈴薯（Solanum tuberosum）[36]。

由于植物體內(nèi)的病毒分布不均勻[37]，被感染的莖尖經(jīng)受低溫療法后，通過液氮冷凍，在生長點(diǎn)基部的部分細(xì)胞，和更多發(fā)達(dá)的葉原基被殺死，這些細(xì)胞通常被植物病原菌感染，尤其是病毒。相比之下，在生長點(diǎn)上部的細(xì)胞和最原始的1、2葉原基在經(jīng)受冷凍后存活，這些細(xì)胞沒有或者含有非常少量的病原菌[38]。隨后，經(jīng)受冷凍療法之后的再生植株則是不含病原菌的[11，12， 28，29 ]。因而低溫療法可以將含有病毒的細(xì)胞凍死， 而保留不含病毒的細(xì)胞，再生材料即可脫除病毒[39]。

3 小結(jié)和展望

和傳統(tǒng)的分生組織培養(yǎng)相比，莖尖低溫療法可以高頻率的獲得無病原菌植株，而且避免了非常小的莖尖剝離和植株再生的困難。低溫療法作為一種新的脫除植物病毒的方法，已成功用于多種植物多種病毒的脫除，這些研究為一些極難脫除病毒的植物提供了一條可行途徑。但是該技術(shù)是超低溫保存方面研究的較新領(lǐng)域，相對于其它脫毒技術(shù)，其發(fā)展歷史還很短，相關(guān)研究還不多。因此，還需進(jìn)一步優(yōu)化低溫療法，拓展適宜脫毒的植物種類，提高脫毒效果。相信隨著研究的深入進(jìn)行和技術(shù)的進(jìn)步，低溫療法應(yīng)用于植物脫除病毒的研究將會越來越廣泛。參 考 文 獻(xiàn)：

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