王永 蘭青闊 趙新 朱珠 程奕

摘要：以轉(zhuǎn)基因Bt水稻品種科豐6號為主要研究對象，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP），針對cry1Ac晶體蛋白毒素基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65 ℃保溫30 min，通過熒光顯色完成對轉(zhuǎn)基因檢測工作。結(jié)果顯示，該LAMP方法能夠特異性檢測cry1Ac基因，其最低定性檢測限是傳統(tǒng)PCR方法的10倍。本研究建立的針對轉(zhuǎn)基因水稻cry1Ac基因的LAMP檢測方法具有高度的特異性及穩(wěn)定性，結(jié)果可靠，非常適合轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的快速檢測。

關(guān)鍵詞：抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因水稻；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)；檢測

中圖分類號：S511文獻標(biāo)識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.01.002

Development and Application of Loop-Mediated Isothermal Amplification for Detection of Transgenic Insect-resistant Rice with Bt Gene

WANG Yong，LAN Qing-kuo，ZHAO Xin，ZHU Zhu，CHENG Yi

（Central Lab of Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin 300381，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ: To develop a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of transgenic insect-resistant rice with Bt（Bacillus thuringiensis）gene. The detection assay is based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction. The cry1Ac gene was amplified by a set of four specially primers that recognize six distinct sequences of the target. The amplification can be obtained in 30 min by incubating all of the reagents in a single tube with Bst DNA polymerase at 65 °C. Results showed that sensitivity of the LAMP assay were 10 times higher on the detection limit for cry1Ac gene than conventional PCR assay. Our results clearly demonstrated that the LAMP-based assay was a sensitive and reliable means for the detection of transgenic insect-resistant rice with Bt gene.

Key words: transgenic insect-resistant rice with Bt gene; loop-mediated isothermal amplification（LAMP）; detection

自1996年轉(zhuǎn)基因作物開始大規(guī)模商業(yè)化種植以來，生物技術(shù)育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，始終保持強勁的發(fā)展勢頭，轉(zhuǎn)基因作物1996年種植面積190萬hm2，2010年達到1.48億hm2，市場產(chǎn)值從最初1995年的0.75億美元增加到2010年的112億美元，15年間增加近150倍[1]。然而轉(zhuǎn)基因作物在帶來巨大社會和經(jīng)濟效益的同時也存在許多問題，主要集中在轉(zhuǎn)基因生物的食用安全性及對環(huán)境的生態(tài)安全性方面。我國高度重視農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理，自2001年以來相繼出臺了一系列轉(zhuǎn)基因生物安全條例和配套管理辦法，特別是在2006年通過了《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》，明確規(guī)定在中國境內(nèi)銷售列入標(biāo)識的轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品，必須進行是否含有轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識。隨著轉(zhuǎn)基因食品的大量涌入市場，建立快速有效的轉(zhuǎn)基因檢測方法，為進一步完善我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理和轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識管理制度，保護消費者知情權(quán)方面提供重要技術(shù)保障。

目前，針對轉(zhuǎn)基因水稻外源基因片段的檢測方法常見的有PCR、實時熒光定量PCR法、色譜法、毛細管凝膠電泳法和多重PCR 等[2-3]。由于上述方法存在操作步驟繁瑣，檢測時間較長；對檢驗人員的知識、操作水平和儀器水平要求過高；難于實現(xiàn)現(xiàn)場實時檢測和跟蹤檢測；檢測成本過高等不足之處，方法較難普及。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是2000年Notomi開發(fā)的一種新的等溫擴增方法。LAMP法原理是利用DNA雙鏈在65 ℃左右處于一種動態(tài)解鏈平衡的狀態(tài)之下，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）作用下，擴增出大量的DNA片段，幾十分鐘可達l09～l010個拷貝[4]。LAMP法廣泛應(yīng)用于包括病毒[5-7]、細菌[8-10]和寄生蟲等傳染性疾病的定性和定量檢測，但用于轉(zhuǎn)基因水稻檢測還沒有報到。在本研究中，將LAMP方法用于檢測抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因水稻的外源cry1Ac基因，以建立轉(zhuǎn)基因水稻的基因特異性LAMP快速檢測方法。

1材料和方法

1.1材 料

抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因水稻科豐6號和非轉(zhuǎn)基因水稻由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實驗室保存。

1.2儀器和試劑

ABI 2720基因擴增儀，梅特勒十萬分之一分析天平，Neslab水浴鍋，Beckman高速冷凍離心機，Nanodrop ND1000蛋白核酸測定儀， Bio-rad電泳儀，SYNGENE G-BOX凝膠成像分析儀等；所用試劑除特殊說明外，其它均購自BBI公司。

1.3樣品DNA提取

參照農(nóng)業(yè)部953號公告－6－2007[11]。

1.4引物設(shè)計及合成

根據(jù)LAMP引物設(shè)計原則，將GeneBank 公布的cry1Ac基因序列（accession number BD276264.1）[12]分成6個區(qū)段（F3/F3c區(qū)、F2/ F2c區(qū)、F1/ F1c區(qū)、B1/ B1c區(qū)、B2/ B2c區(qū)、B3/B3c區(qū)）（圖1），其中LAMP擴增區(qū)域位于cry1Ac基因序列的23～243 bp之間，引物序列見表1。

引物由寶生物公司合成，純度為HPLC級別。引物用滅菌去離子水溶解，配制成100 μmol·L-1母液，取FIP和BIP母液各8 μL，取F3和B3母液各1 μL，用滅菌去離子水補足20 μL，為引物混合溶液。

1.5LAMP擴增

LAMP反應(yīng)在25 μL體系中進行，包括10×ThermoPol Reaction buffer（New England Biolabs）2.5 μL，0.2 mol·L-1 MgSO4 0.25 μL, 10 mmol·L-1 dNTP（Promega）1 μL，4 mol·L-1 Betaine（Sigma）6.25 μL，引物混合液1 μL，8 000 U·mL-1 Bst DNA聚合酶大片段（New England Biolabs）1 μL，DNA模板2 μL，滅菌去離子水補足25 μL。

反應(yīng)體系在59~69 ℃下恒溫擴增60 min，之后在80 ℃保溫2 min滅活DNA聚合酶。擴增結(jié)束后取擴增產(chǎn)物10 μL，與溴酚蘭混合，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V電壓下40 min，在凝膠成像分析儀中觀察結(jié)果。

1.6 PCR擴增

PCR 反應(yīng)引物由上海生工參照文獻[12]合成。PCR反應(yīng)為25 μL體系，10×PCR buffer（Promega）2.5 μL，10 mmol·L-1 dNTPs（Promega）0.5 μL，上游和下游引物（10 mmol·L-1）各0.5 μL，Taq酶（5 U·μL-1，Promega）0.5 μL，DNA模板1 μL，滅菌去離子水19.5 μL。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物取10 μL于2%瓊脂糖凝膠電泳，100 V電壓下40 min，通過凝膠成像分析儀觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

以含10 %轉(zhuǎn)基因水稻DNA為模板，體系分別在59，61，63，65，67 ℃下溫育60 min，取擴增產(chǎn)物4 μL，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果，結(jié)果顯示體系在65 ℃下有擴增產(chǎn)物，且在65 ℃下條帶較明亮清晰（圖2）。以65℃為反應(yīng)溫度，對最少反應(yīng)時間進行了研究，結(jié)果顯示反應(yīng)在60 min和75 min均出現(xiàn)擴增產(chǎn)物，并且結(jié)果一致（圖2）。故本研究選擇65 ℃為反應(yīng)的最優(yōu)擴增溫度，60 min為最佳反應(yīng)時間。

2.2LAMP靈敏度分析

取抗蟲水稻品種科豐6號和非轉(zhuǎn)基因水稻，液氮研磨呈細粉，干燥至恒質(zhì)量。用十萬分之一分析天平稱取轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻，按比例混合，使轉(zhuǎn)基因水稻占總重的10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.01%、0 %，充分混勻，提取DNA。以上述DNA為模板分別進行LAMP擴增和PCR擴增，電泳結(jié)果見圖3和圖4。由圖3可見，泳道1～7中均出現(xiàn)典型的LAMP的梯狀帶型，最低檢測限度可以達到0.01％；由圖4可見，泳道1～5 PCR都擴增出301 bp大小的特異性條帶，且亮度逐漸降低，傳統(tǒng)PCR擴增的最低檢出限為0.5％，但亮度很弱。

3討論與結(jié)論

目前在轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分檢測中，定性PCR方法應(yīng)用最為廣泛。PCR法檢測依賴PCR儀進行核酸體外擴增，其PCR擴增產(chǎn)物需要凝膠電泳分析才能完成，從擴增到出結(jié)果需要3 h左右，而且在操作過程中容易產(chǎn)生氣溶膠污染，檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性和假陰性。同PCR技術(shù)相比，LAMP技術(shù)在檢測領(lǐng)域具有較大優(yōu)勢：（1）操作簡便，反應(yīng)不需要復(fù)雜的儀器，只需一個維持恒定溫度的金屬加熱塊或者水浴鍋就能反應(yīng)，產(chǎn)物分析可以用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)的混濁情況就可以判斷擴增與否；（2）快速高效，檢測靈敏度高，整個擴增1 h即可完成，產(chǎn)量可達到109~1010個拷貝，如果在反應(yīng)中加入環(huán)狀引物還可以促進擴增，減少反應(yīng)時間；（3）特異性高，該技術(shù)由4條引物擴增靶序列的6個區(qū)段，具有高度特異性，不易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而且在環(huán)狀引物上可以加上熒光探針，更進一步提高反應(yīng)的特異性；（4）反應(yīng)整個過程可以閉管操作，可以從源頭上控制氣溶膠污染。因此，本研究建立的轉(zhuǎn)基因作物L(fēng)AMP檢測方法具有高度的特異性及穩(wěn)定性，結(jié)果可靠，非常適合轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測，有較好的應(yīng)用價值。

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收稿日期：2011-11-01；修訂日期：2012-01-29

基金項目：國際合作項目（2006DFA32380）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究（08JCYBJC03700）

作者簡介：王永（1977-），男，天津人，副研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量分子檢測技術(shù)研究。

通訊作者簡介：程奕（1963-），女，安徽歙縣人，研究員，碩士，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測研究。