李進(jìn)軍，張瑞星，楊 華，張風(fēng)賓，郭占軍*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院醫(yī)療保險(xiǎn)辦公室，河北石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科，河北石家莊 050011））

·論 著·

SET8基因3’端非翻譯區(qū)的m iR-502結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

李進(jìn)軍1，張瑞星2，楊 華2，張風(fēng)賓2，郭占軍2*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院醫(yī)療保險(xiǎn)辦公室，河北石家莊 050011；

2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院消化內(nèi)科，河北石家莊 050011））

目的研究SET8基因3’端非翻譯區(qū)的miR-502結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。方法在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院完成肝癌患者80例SET8基因3’端非翻譯區(qū)的miR-502結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性測(cè)序分析，生存曲線分析采用Kaplan-Meier方法，組間對(duì)比使用Log-rank檢驗(yàn)，使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者SET8基因3’端非翻譯區(qū)種子區(qū)域miR-502結(jié)合部位一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)rs16917496 CC基因型患者生存時(shí)間較長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（相對(duì)危險(xiǎn)度0.187，95%可信區(qū)間0.073～0.757，P= 0.005）。結(jié)論SET8基因3’端非翻譯區(qū)的miR-502結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是肝癌患者預(yù)后的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

肝腫瘤；RNA；預(yù)后；多態(tài)性，單核苷酸

肝癌是第4大常見(jiàn)惡性腫瘤，每年大約有50萬(wàn)患者死亡，病死率居世界第3位，肝癌的惡性程度和缺乏有效的治療手段困擾著研究人員，肝癌的發(fā)生與多種風(fēng)險(xiǎn)因素有關(guān)，包括慢性乙型肝炎病毒，慢性丙型肝炎病毒和酒精損害等［1］。在亞洲和非洲，慢性乙型和丙型肝炎病毒流行高于其他大洲，因此肝癌的發(fā)生率在這2個(gè)大洲持續(xù)升高，在中國(guó)慢性乙型肝炎病毒感染是一個(gè)具有挑戰(zhàn)的健康問(wèn)題，大約9 000萬(wàn)人是病毒攜帶者，其中3000萬(wàn)人已經(jīng)出現(xiàn)慢性肝臟損害。同時(shí)在中國(guó)酒精性肝病患者也持續(xù)增加，人口統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)6.6%男性和0.1%女性被診斷為酒精依賴，很多人將發(fā)展為肝病，而酒精性肝病和肝硬化更容易進(jìn)展為肝癌［2］。盡管臨床診斷和治療有了長(zhǎng)足發(fā)展，但肝癌復(fù)發(fā)機(jī)會(huì)仍很高，預(yù)后差。到目前為止肝癌致病的機(jī)制仍不明確，本研究探討SET8基因3’端非翻譯區(qū)的miR-502結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2003年9月—2008年7月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院肝膽外科手術(shù)患者80例，其中男性66例，女性14例，年齡23～70歲，平均58.4歲，包括乙型肝炎相關(guān)性肝癌患者56例，酒精性肝癌患者10例，丙型肝炎相關(guān)性肝癌患者14例?；颊咝g(shù)后每3個(gè)月隨訪1次，共隨訪3年，所有患者術(shù)后未接受化療或放療，術(shù)前均空腹抽取外周靜脈血，外周血標(biāo)本當(dāng)天提取DNA后置于-80℃恒溫冰箱保存。

1.2 研究方法：PCR擴(kuò)增DNA和序列分析，正向和反向引物，5-TCACGACGGTGCTACCTAAG-3，5-CATGCTGGTGTGACACAGTC-3，依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)擴(kuò)增SET8基因3’非編碼區(qū)rs16917496目的片段基因。使用PCR預(yù)混試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序，測(cè)序試劑為BigDye terminator v3.1，測(cè)序儀器為ABIPRISM31000XL DNA序列分析儀，同一標(biāo)本采用雙向重復(fù)測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，生存曲線分析采用Kaplan-Meier方法，組間對(duì)比使用Log-rank檢驗(yàn)，使用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本研究共收集患者80例，患者的臨床特征和3年生存期分析使用Kaplan-Meier方法，采用Logrank檢驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)患者的性別和年齡與術(shù)后生存時(shí)間無(wú)關(guān)，而腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、Child分級(jí)和有無(wú)門(mén)脈瘤栓與生存時(shí)間有關(guān)，結(jié)果見(jiàn)表1。不同臨床分期患者有相應(yīng)地生存率，Ⅰ～Ⅱ期患者生存率為46.3%，Ⅲ期患者生存率為0.0%，不同的分期其生存時(shí)間有明顯差別，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；有無(wú)門(mén)脈瘤栓和Child分級(jí)與患者總的生存時(shí)間有關(guān)（P＜0.01，P＜0.05）；同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤＞5cm和≤5cm比較，單個(gè)腫瘤和多個(gè)腫瘤比較時(shí)，生存時(shí)間有明顯差異（P＜0.01，P＜0.05）。這些研究發(fā)現(xiàn)表明臨床分期、有無(wú)門(mén)脈瘤栓、腫瘤大小、Child分級(jí)和腫瘤數(shù)量與肝癌患者的預(yù)后有關(guān)。

表1 肝癌患者的臨床特征與術(shù)后生存期的關(guān)系Table 1 Correlation between clinical characteristics and post-operative survival in HCC patients

本研究對(duì)80例肝癌患者多態(tài)位點(diǎn)rs16917496的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)肝癌患者SET8CC、CT和TT基因型頻率分別為11、50和72，rs16917496位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。隨后我們分析了rs16917496位點(diǎn)多態(tài)性和肝癌患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系。根據(jù)rs16917496位點(diǎn)基因型，肝癌患者被分為3組，術(shù)后生存曲線分析采用Kaplan-Meier法。CC、CT、TT 3種基因型患者3年生存率分別為50.0%、39.3%和40.1%，研究發(fā)現(xiàn)生存率有明顯差異，C/C等位基因型患者相對(duì)于C/T和T/T基因型患者生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CC與CT比較，P= 0.007；CC與TT比較，P=0.011）（圖1～2）。CT與TT基因型相比生存時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些數(shù)據(jù)表明CC基因型與肝癌患者生存時(shí)間長(zhǎng)和預(yù)后好相關(guān)。

圖1 SET8基因CC與TT基因型患者生存期比較Figure 1 Comparison of survival time between the patients with C/C allele and thosewith T/T allele

我們使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析了臨床分期、門(mén)脈瘤栓、Child分級(jí)、腫瘤大小和腫瘤數(shù)量這些預(yù)測(cè)因子，研究證實(shí)rs16917496位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)可作為肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素（相對(duì)危險(xiǎn)度0.187，95%CI 0.073～0.757，P=0.005）。臨床分期、門(mén)脈瘤栓、腫瘤大小、Child分級(jí)也可以作為肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。這些數(shù)據(jù)均表明SET8基因rs16917496單核苷酸多態(tài)性可作為肝癌患者的預(yù)后指標(biāo)。見(jiàn)表2。

圖2 SET8基因CC與CT基因型患者生存期比較Figure 2 Comparison of survival time between the patients with C/C allele and thosewith C/T allele

表2 肝癌患者Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析Table 2 M ultivariate analysis of prognostic factors associated w ith post-operative survival in HCC patientswith Cox proportional hazardsmodel

3 討 論

miRNAs是長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子，通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制。miRNAs在許多生物調(diào)節(jié)過(guò)程中起了重要作用，如細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡、腫瘤的發(fā)生、胰島素分泌等［3-4］。在人體中發(fā)現(xiàn)超過(guò)700種miRNAs，這些miRNAs參與了至少30%蛋白質(zhì)編碼基因的調(diào)節(jié)［5］。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs和端3’非翻譯區(qū)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)結(jié)合后導(dǎo)致靶基因表達(dá)改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［6］。在基因研究方面，盡管miRNA結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性近來(lái)被廣泛研究，但miRNA結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性與腫瘤預(yù)后關(guān)系的研究甚少。

SET8基因編碼組蛋白H4賴氨酸20單甲基轉(zhuǎn)移酶，與正常細(xì)胞周期有關(guān)。SET8mRNA 3’端非編碼區(qū)有miR-502的結(jié)合位點(diǎn)，miR-502與其結(jié)合后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs16917496位于SET8基因3’端非編碼區(qū)miR-502的結(jié)合區(qū)域內(nèi)，以往研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與SET8基因表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)，與腫瘤的早期發(fā)生有關(guān)［7］。

本研究發(fā)現(xiàn)SET8基因3’端非翻譯區(qū)的miR-502結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可作為肝癌患者預(yù)后的指標(biāo)，該位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與SET8基因的表達(dá)的調(diào)節(jié)有關(guān)，基因表達(dá)的改變可能通過(guò)某種隱性方式影響了肝癌患者的生存時(shí)間。本研究首次報(bào)道了SET8基因單核苷酸多態(tài)性可能是肝癌的一種病因。由于研究的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)位于SET8基因3’非編碼區(qū)與miR-502結(jié)合的種子區(qū)域，miR-502和SET8基因3’非編碼區(qū)結(jié)合部位rs16917496位點(diǎn)T突變?yōu)镃改變了原有的G∶C結(jié)合，進(jìn)而影響了SET8基因的表達(dá)。我們的研究發(fā)現(xiàn)SET8基因表達(dá)的改變影響了肝癌患者的預(yù)后，而SET8基因表達(dá)的調(diào)節(jié)至少部分與miR-502結(jié)合有關(guān)。Song等［7］也研究發(fā)現(xiàn)SET8基因CC型與RNA表達(dá)水平低有關(guān)，我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)CC基因型與RNA的低表達(dá)有關(guān)，肝癌患者CC基因型生存時(shí)間長(zhǎng)。

多因素分析表明SET8基因3’端非翻譯區(qū)的miR-502結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是肝癌預(yù)后一種獨(dú)立因素，與所有miRNAs單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)一樣，我們所研究的位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性也是疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素［8］。以往研究發(fā)現(xiàn)這些單核苷酸多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，是致癌風(fēng)險(xiǎn)因素。

SET8作為一種甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)與p53基因序列結(jié)合的組蛋白382賴氨酸甲基化，進(jìn)而影響p53基因的表達(dá)，改變它的轉(zhuǎn)錄活性。SET8的缺失促進(jìn)了p53的凋亡，影響了它的作用。p53甲基化影響SET8基因的表達(dá)與肝癌患者生存率之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。以往研究發(fā)現(xiàn)SET8基因剔除后可以抑制p53的生物活性，進(jìn)而加速了細(xì)胞壞死過(guò)程［9］。

Yu等［10］采用病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)12個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)在多種腫瘤中顯示出異常的等位基因頻率，已經(jīng)證實(shí)SET8基因miR-502結(jié)合位點(diǎn)是其中之一。我們研究了該位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在正常對(duì)照組中的頻率分布，發(fā)現(xiàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但不排除該位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性在不同腫瘤中具有不同的作用。

盡管對(duì)miRNAs結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的研究處于早期階段，以往研究發(fā)現(xiàn)miRNAs是影響包括腫瘤在內(nèi)的其他疑難疾病治療效果的一種關(guān)鍵因素［11］。本研究發(fā)現(xiàn)miRNAs等位基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后有關(guān)，這是令人鼓舞的。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SET8基因3’端非翻譯區(qū)的miR-502結(jié)合位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性是肝癌預(yù)后的一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這一發(fā)現(xiàn)將有助于劃分肝癌患者預(yù)后好壞的分組，并有助于肝癌患者治療方案的選擇。

［1］ CALDWELL S，PARK SH.The epidemiology of hepatocellular cancer：from the perspectives of public health problem to tumor biology［J］.JGastroenterol，2009，44（Suppl19）：96-101.

［2］ LU FM，ZHUANG H.Management of hepatitis B in China［J］. Chin Med J（Engl），2009，122（1）：3-4.

［3］ BARTEL DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281-297.

［4］ AMBROS V.The functions of animal microRNAs［J］.Nature，2004，431（7006）：350-355.

［5］ ZENG Y，WAGNER EJ，CULLEN BR.Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells［J］.Mol Cell，2002，9（6）：1327-1333.

［6］ BRENDLE A，LEI H，BRANDT A，et al.Polymorphisms in predicted microRNA-binding sites in integrin genes and breast cancer：ITGB4 as prognostic marker［J］.Carcinogenesis，2008，29（7）：1394-1399.

［7］ SONG F，ZHENG H，LIU B，et al.An miR-502-binding site single-nucleotide polymorphism in the 3’-untranslated region of the SET8 gene is associated with early age of breast cancer onset［J］.Clin Cancer Res，2009，15（19）：6292-6300.

［8］ HORIKAWA Y，WOOD CG，YANG H，et al.Single nucleotide polymorphisms ofmicroRNA machinery genes modify the risk of renal cell carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2008，14（23）：7956-7962.

［9］ SHIX，KACHIRSKAIA I，YAMAGUCHIH，et al.Modulation of p53 function by SET8-mediated methylation at lysine 382［J］. Mol Cell，2007，27（4）：636-46.

［10］ YU Z，LI Z，JOLICOEUR N，et al.Aberrant allele frequencies of the SNPs located in microRNA target sites are potentially associated with human cancers［J］.Nucleic Acids Research，2007，35（13）：4535-4541.

［11］ IORIO MV，F(xiàn)ERRACIN M，LIU CG，et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer［J］.Cancer Res，2005，65（16）：7065-7070.

（本文編輯：劉斯靜）

本刊對(duì)修改文稿中插圖的要求

為確保本刊的印刷質(zhì)量，本刊對(duì)修改文稿中插圖的要求規(guī)定如下。

一、對(duì)照相圖片的要求：無(wú)論黑白圖片還是彩色圖片，均需以電子文件JPG格式或JPEG格式隨修改文稿正文發(fā)送至hbydxbxg@126.com郵箱。主題寫(xiě)：稿號(hào)插圖（例如：03080268插圖）。

二、對(duì)線條圖的要求：線條圖請(qǐng)用Illustrator 1.0以上版本繪制，線條用0.2mm粗的線，文字?jǐn)?shù)據(jù)需用6號(hào)字以上。發(fā)送修改文稿正文時(shí)將線條圖一并發(fā)至hbydxbxg@126.com郵箱。

以上要求請(qǐng)盡力做到，如有疑問(wèn)請(qǐng)與我部聯(lián)系。聯(lián)系電話：（0311）86266109。

謝謝合作！

《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》編輯部

ASSOCIATION OF POLYMORPHISM AT THE m iR-502 BINDING SITE IN THE 3’UNTRANSLATED REGION OF THE HISTONE METHYLTRANSFERASE
SET8 W ITH HEPATOCELLULAR CARCINOMA OUTCOM E

LI Jinjun1，ZHANG Ruixing2，YANG Hua2，ZHANG Fengbin2，GUO Zhanjun2*
（1.Medical Insurance Office，the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；
2.Departmentof Gastroenterology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China）

ObjectiveTo investigate the association of polymorphism at themiR-502 binding site in the 3’untranslated region（UTR）of the histone methyltransferase SET8 with hepato cellular carcinoma outcome.MethodsThe region of single nucleotide polymorphism（SNP）in the miR-502 binding site of the SET8 3’UTR was sequenced for 80 hepatocellular carcinoma patients recorded in the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Survival curves were calculated using the Kaplan-Meier method，and comparisons between the curves weremade using the Log-rank test.Multivariate survival analysiswas performed using a Cox proportional hazardsmodel.ResultsSingle nucleotide polymorphism（rs16917496）within the miR-502 microRNA seed region for the 3’UTR of SET8 in Chinese HCC patients was found.The SET8 CC genotype was independently associated with longer post-operative survival in HCC patients by multivariate analysis（relative risk，0.187；95%CI，0.073-0.757；P= 0.005）.ConclusionSNP in the miR502 binding site of the SET8 3’UTR was found to be an independent prognostic marker for HCC outcome.

liver neoplasms；RNA；prognosis；polymorphism，single nucleotide

R735.7

A

1007-3205（2012）03-0252-04

2011-11-17；

2012-02-18

李進(jìn)軍（1970-），男，河北寧晉人，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事腫瘤防治管理工作。

*通訊作者。E-mail：zjguo5886@yahoo.com.cn

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.03.003