楊慧榮，趙會宏 ，蒙子寧 ，劉 麗 ，林權(quán)卓

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動物研究所暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275)

赤眼鱒Squaliobarbuscurriculus屬鯉科Cyprinidae，雅羅魚亞科Leuciscinae，赤眼鱒屬Squaliobarbus，俗稱紅眼棒、野草魚、參魚，是廣布中國主要水系的野生經(jīng)濟(jì)魚類[1]。赤眼鱒因其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，具有抗病力強(qiáng)，食性雜，生長較快等特點(diǎn)，成為我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類之一。目前，有關(guān)赤眼鱒的研究主要集中于資源狀況、基礎(chǔ)生物學(xué)、養(yǎng)殖和人工繁殖方面[2-3]，而關(guān)于其群體遺傳學(xué)與基因多樣性研究則鮮有報(bào)道，僅2008年楊太有等[4-6]用RAPD和ISSR技術(shù)對丹江口水庫、青龍湖和宿鴨湖3地理群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析。

線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)具有母性遺傳、進(jìn)化速度快、核苷酸替代率高等特點(diǎn)，已成為魚類進(jìn)化生物學(xué)和群體遺傳學(xué)研究的重要遺傳標(biāo)記[7-8]。mtDNA基因組內(nèi)不同的區(qū)域進(jìn)化速度存在差異，適合不同水平的進(jìn)化研究。在mtDNA上，位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間的D控制區(qū)(D-loop)是整個(gè)mtDNA上序列和長度變異最大的區(qū)域[9]，也線粒體基因中進(jìn)化最快的部分，適用于種群水平差異的檢測，也可用于種間分析[7-10]。而Cytb基因是線粒體DNA上的蛋白質(zhì)編碼基因，其進(jìn)化速度適中，適合種群水平差異的檢測，是探討種間和種內(nèi)遺傳分化程度的良好標(biāo)記[11-13]。本研究開展了珠江水系和長江水系不同水域赤眼鱒mtDNA D-loop和Cytb基因序列的對比分析，旨在研究這兩種遺傳標(biāo)記對赤眼鱒遺傳多樣性狀況和群體遺傳結(jié)構(gòu)的差異，探討mtDNA D-loop和Cytb基因?qū)τ谌后w遺傳多樣性分析的優(yōu)缺點(diǎn)，進(jìn)而為針對不同研究材料、不同研究目的，選擇不同的分析方法提供技術(shù)上的指導(dǎo)，使得結(jié)論更客觀真實(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

赤眼鱒樣品于2005年6月分別采自長江水系的宜昌和武漢江段(編號為YC群體、WH群體)，珠江水系梧州和新豐江段(編號為WZ群體、XF群體)。YC群體取自宜昌巴東縣的官渡口，屬于長江上游干流巫峽的起點(diǎn)；WH群體取自武漢市境內(nèi)江段，屬于長江中游水域；WZ群體和XF群體分布代表了珠江水系的西江和東江流域。共計(jì)24個(gè)個(gè)體，均為野生群體?；铙w運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后取背部肌肉并置于超低溫冰箱，取樣后的赤眼鱒用福爾馬林固定保存。

1.2 方法

基因組DNA的提取參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[14]的方法略加改進(jìn)。PCR反應(yīng)在Biometra PCR儀上進(jìn)行。D-loop和Cytb引物由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成，D-loop引物序列如下：DL1：5'-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3'，DH2：5'-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3'[15]。Cytb引物序列如下：L14724：5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3'，H15915：5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'[12]。反應(yīng)總體積50 μL，其中10×Taq Buffer 5 μL，Taq Polymerase 0.5 μL (5 U·μL-1)，dNTPs(2.5 mmol·L-1)4 μL，Mg2+(25 mmol·L-1)2.5 μL，引物1和2(10 umol·L-1)各2 μL，模板DNA 50 ng，無離子超純水35.5 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min后，再進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括：94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min；最后72 ℃延伸7 min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)不含模板DNA的空白對照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)w=1.5%TBE瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，紫外燈光下檢測、拍照。

1.3 測序與數(shù)據(jù)分析

產(chǎn)物純化和序列測定由上?；倒?Gene core Co.)完成，通過雙向測序獲得赤眼鱒D-loop和Cytb序列，經(jīng)SeqManII (DNASTAR Inc)軟件拼接并賦予人工校對后，用CLUSTAL-X程序?qū)λ@得的序列進(jìn)行比對[16]，采用軟件DAMBE統(tǒng)計(jì)單倍型并作圖，檢測轉(zhuǎn)換、顛換是否達(dá)飽和。群體的遺傳多樣性指標(biāo)單倍型多樣性(Haplotype diversity,H)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,π)由ARLEQUIN[17]統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算獲得，群體間的分化指數(shù)(F-statistics,FST)[18]的計(jì)算在ARLEQUIN中完成，群體間的基因流[19]由公式Nm=[(1/FST)-1]/2計(jì)算得出，群體遺傳變異的分子方差分析(AMOVA)[20]在ARLEQUIN中完成。采用MEGA4.1軟件[21]統(tǒng)計(jì)DNA序列的堿基組成，轉(zhuǎn)換/顛換、插入/缺失位點(diǎn)數(shù)，單突變位點(diǎn)，簡約信息位點(diǎn)和平均轉(zhuǎn)換/顛換率；利用Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算個(gè)體間、群體內(nèi)和群體間的遺傳變異率；用NJ法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類關(guān)系樹。

2 結(jié) 果

2.1 D-loop和Cyt b基因序列信息

由軟件DAMBE統(tǒng)計(jì)可知：在24個(gè)598 bp的D-loop基因序列中共檢測出18個(gè)單倍型。由MEGA4.1軟件對D-loop基因序列進(jìn)行分析，檢測到18個(gè)單突變位點(diǎn)，34個(gè)簡約信息位點(diǎn)數(shù)；在67個(gè)突變位點(diǎn)中：轉(zhuǎn)換位點(diǎn)40個(gè)，顛換位點(diǎn)15個(gè)(其中有2個(gè)位點(diǎn)即發(fā)生了轉(zhuǎn)換，又發(fā)生了顛換)，插入/缺失位點(diǎn)14個(gè)，轉(zhuǎn)換明顯高于顛換，平均的轉(zhuǎn)換發(fā)生頻率是顛換的3.192。24個(gè)個(gè)體D-loop基因片段中，T、C、A、G堿基的平均含量分別為35.1%，17.5%，33.7%，13.7%，其中，A+T的含量(68.8%)明顯高于C+G的含量(31.2%)。同樣，在24個(gè)752 bp的Cytb基因序列中共檢測出18個(gè)單倍型，檢測到4個(gè)單突變位點(diǎn)，68個(gè)簡約信息位點(diǎn)數(shù)；在72個(gè)突變位點(diǎn)中：轉(zhuǎn)換位點(diǎn)60個(gè)，顛換位點(diǎn)15個(gè)(其中有3個(gè)位點(diǎn)即發(fā)生了轉(zhuǎn)換，又發(fā)生了顛換)，無插入/缺失位點(diǎn)，轉(zhuǎn)換明顯高于顛換，平均的轉(zhuǎn)換發(fā)生頻率是顛換的4.636。T、C、A、G堿基平均含量分別為26.4%，29.8%，29.3%，14.5%，其中，A+T的含量(55.7%)略高于C+G的含量(44.3%)。對比分析可知：Cytb除簡約信息位點(diǎn)百分比大于D-loop外，多態(tài)位點(diǎn)百分比和單突變位點(diǎn)百分比均小于D-loop(表1)。

表1 赤眼鱒線粒體D-loop 及Cyt b堿基組成及變異分析

2.2 D-loop和Cyt b基因序列的遺傳變異分析

用軟件MEGA4.1統(tǒng)計(jì)出兩水系4個(gè)不同水域赤眼鱒各個(gè)體間的轉(zhuǎn)換/顛換數(shù)及遺傳變異率。D-loop序列中，各個(gè)體間的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)為0～24，顛換位點(diǎn)為0～8，均為轉(zhuǎn)換大于顛換。兩大水系4個(gè)不同群體個(gè)體間的遺傳變異率在0～5.93%之間，赤眼鱒不同個(gè)體與青魚的遺傳變異率在19.09%～20.43%之間。4個(gè)不同群體赤眼鱒(WZ、XF、WH和YC)群體內(nèi)的遺傳距離分別是0.012 0、0.016 2、0.009 9和0.004 8，群體間的遺傳距離值為0.007 0～0.049 1，總平均遺傳距離為0.029 3(不含外群)。Cytb序列中，各個(gè)體間的轉(zhuǎn)換位點(diǎn)為0～51，顛換位點(diǎn)為0～13，均為轉(zhuǎn)換大于顛換。兩大水系4個(gè)不同群體個(gè)體間的遺傳變異率在0～8.78%之間，而赤眼鱒不同個(gè)體與青魚的遺傳變異率在11.61%～12.48%之間。4個(gè)不同群體赤眼鱒(WZ、XF、WH和YC)群體內(nèi)的遺傳距離分別是0.010 9、0.007 3、0.003 8和0.005 2，群體間的遺傳距離值為0.004 3～0.082 7，總平均遺傳距離為0.045 5(不含外群)(表2)。

4個(gè)群體的D-loop和Cytb序列的單倍型多樣性(H)、平均核苷酸差異數(shù)(K±SD)、核苷酸多樣性(π)見表3。4個(gè)群體間的FST及Nm值見表4。從表4可以看出：武漢群體與新豐群體及梧州群體的遺傳差異顯著，宜昌群體與新豐群體及梧州群體的遺傳差異顯著，而同一水系內(nèi)的不同群體差異不顯著。把4個(gè)群體作為一個(gè)組進(jìn)行群體間的分子變異等級分析(AMOVA)(表4)，結(jié)果表明：不管D-loop，還是Cytb，群體間都存在顯著性遺傳差異(FST=0.689 77或0.871 94，P=0.000 0<0.05)。

表2 兩大水系4個(gè)不同水域赤眼鱒D-loop和Cyt b基因序列群體內(nèi)(對角線上)、群體間(對角線下)以及總平均(最后行)遺傳距離1)

表3 4個(gè)赤眼鱒群體相關(guān)遺傳多樣性指標(biāo)1)

表4 群體間的FST(對角線下方)和Nm(對角線上方)1)

表5 群體間的遺傳變異的分子變異等級分析(AMOVA)1)

2.3 分子系統(tǒng)樹

以青魚MylopharyngodonpiceusD-loop和Cytb基因序列為外群，用MEGA4.1中的“NJ”法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)見圖1。用Bootstrap 1000給出各支的置信度，最高為100，最低為17。兩大水系4個(gè)不同水域赤眼鱒24個(gè)個(gè)體的系統(tǒng)樹明顯分為兩支：珠江12個(gè)個(gè)體聚為一支，長江12個(gè)個(gè)體聚為另一支，且都有較高的置信度，各大水系內(nèi)的不同水域個(gè)體卻混雜在一起。

3 討 論

3.1 D-loop和Cyt b對赤眼鱒遺產(chǎn)多樣性的分析

單倍型多樣性(H)、平均核苷酸差異數(shù)(K±SD)和核苷酸多樣性(π)是反映物種遺傳變異水平的3個(gè)重要參數(shù)，赤眼鱒D-loop和Cytb的H、K和π值分別為0.963 8、16.543 48、0.028 38和0.971 0、31.855 07、0.042 6，與相同技術(shù)對光唇裂腹魚[22-25]的研究結(jié)果相比(表5)，本研究中赤眼鱒各遺傳多樣性參數(shù)值較高。另外，根據(jù)堿基組成的基本信息，赤眼鱒具有較高的單倍型檢出率(數(shù))、多態(tài)位點(diǎn)百分比(數(shù))以及簡約信息位點(diǎn)百分比(數(shù))[22-26]。所以，無論是D-loop，還是Cytb，兩者都很相似地得出赤眼鱒總體較高遺傳多樣性的研究結(jié)果。由于物種特定的遺傳結(jié)構(gòu)、分類地位、生態(tài)習(xí)性及淡、海水魚類在基因交流方面的不同，可能導(dǎo)致它們彼此之間在遺傳分化水平上存在差異，但上述比較，在一定程度上能夠間接反映出赤眼鱒的遺傳多樣性狀況。

圖1 兩大水系4個(gè)不同水域赤眼鱒D-loop(A)和Cyt b(B)基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹(數(shù)值表示1 000次重復(fù)抽樣的百分比)

一般來說，物種遺傳多樣性的高低與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力密切相關(guān)，遺傳變異是有機(jī)體適應(yīng)環(huán)境變化的必要條件[27-28]。雖然赤眼鱒具有較高的遺傳多樣性水平，但由表2、4可以看出，D-loop和Cytb很一致的表明：長江和珠江水系間存在明顯的遺傳變異，可同一水系內(nèi)群體間的遺傳變異和遺傳多樣性并不十分豐富。分子變異分析(AMOVA)結(jié)果也顯示：4個(gè)群體總的遺傳分化指數(shù)為0.689 77和0.871 94(P<0.001)，其中68.98%、87.19%遺傳變異存在于群體間，群體內(nèi)的遺傳變異率對總的遺傳變異貢獻(xiàn)較小。所以，在同一水系內(nèi)部，赤眼鱒的遺傳多樣性狀況并不十分樂觀，加強(qiáng)對現(xiàn)有資源的科學(xué)管理和保護(hù)、恢復(fù)有效種群大小、豐富遺傳多樣性是保護(hù)赤眼鱒自然資源的有效舉措。

3.2 D-loop和Cyt b基因的變異位點(diǎn)比較

在所研究的不同水域赤眼鱒個(gè)體D-loop序列中檢測出了67個(gè)突變位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)的比例高達(dá)11.2%，再一次驗(yàn)證了D-loop序列的高進(jìn)化速率。其中插入/缺失位點(diǎn)14個(gè)，在檢測的Cytb中就沒有發(fā)現(xiàn)插入/缺失位點(diǎn)，在其他的研究中也證實(shí)了該觀點(diǎn)[29,30]，這主要是由于Cyt b用于編碼蛋白質(zhì)，如有插入/缺失的發(fā)生很容易被淘汰；而D-loop片段為非編碼基因，主要與線粒體基因的調(diào)控有關(guān)，不受蛋白功能上的需要和三聯(lián)體密碼的限制，所以插入/缺失突變后比較容易被保留。在D-loop和Cytb的變異位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)換和顛換比值分別為3.192和4.636，通過軟件DAMBE分析所得的轉(zhuǎn)換、顛換對遺傳距離圖可知：D-loop和Cytb的轉(zhuǎn)換和顛換數(shù)沒有達(dá)到平臺效應(yīng)，即沒有達(dá)到飽和狀態(tài)，說明供統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，序列中的堿基替代均具有系統(tǒng)發(fā)育意義[31]，可以用來作為赤眼鱒種內(nèi)的遺傳分析。統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體兩兩之間的轉(zhuǎn)換和顛換數(shù)，每條序列的轉(zhuǎn)換均大于顛換，Gerlach等[32]的研究成果也證實(shí)了該觀點(diǎn)，其原因仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。在D-loop和Cytb基因堿基組成中，A+T含量均高于C+G含量，且D-loop基因中A+T含量要高出Cytb近11.1%，這與其他的研究結(jié)果相一致[33,34]。

表6 不同物種相關(guān)遺傳多樣性指標(biāo)比較1)

3.3 D-loop和Cyt b基因的進(jìn)化比較

線粒體基因組的特性使它已成為進(jìn)化生物學(xué)和群體遺傳學(xué)研究中重要的分子標(biāo)記。目前，研究最多的是Cyt b、12S rRNA、16S rRNA、COⅠ基因和D-loop區(qū)[22-26,30,34-35]。本研究中，盡管D-loop和Cytb很一致的表明長江和珠江水系赤眼鱒存在明顯的遺傳分化，但同一水系內(nèi)群體間的遺傳變異并不豐富，且D-loop和Cytb基因之間也存在差異。由群體間的遺傳距離值和FST值(表2和表4)可以看出，對于同一水系群體間(如WZ-XF，YC-WH)的遺傳差異較小，Cytb則更小，對于不同水系群體間(如WZ-YC和WH，XF-YC和WH)的遺傳差異較大，Cytb則更大，呈現(xiàn)出“小則越小，大則越大”的態(tài)勢。分析其原因，可能與D-loop和Cytb進(jìn)化速率密切相關(guān)。

有研究表明，線粒體不同基因的進(jìn)化速率存在差異[37]。D-loop區(qū)由于不編碼蛋白，受到的選擇壓力最小，所以進(jìn)化速度最快[23,36]。Cytb基因由于編碼線粒體細(xì)胞色素b蛋白，其進(jìn)化速度適中，適合研究種內(nèi)到種間甚至科間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，近年來廣泛地應(yīng)用于爬行類、魚類等的系統(tǒng)發(fā)育、種類鑒別等的研究[38-40]。蒙子寧等[26]認(rèn)為，石斑魚線粒體細(xì)胞色素b基因序列在種內(nèi)變異極小、變異位點(diǎn)數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)等均非常低；但該基因序列在石斑魚種間卻存在較大的核苷酸差異，UPGMA系統(tǒng)樹更是以100%的置信度將斜帶石斑魚和赤點(diǎn)石斑魚區(qū)分開。由此可見，Cytb基因具有保守和變異的雙重特性、保守性決定了該基因不適合做石斑魚的種內(nèi)遺傳變異分析；但其變異性使得該基因適合于種以上水平的種類鑒定。李娜等[23]的研究中，將中國香魚與日本香魚的Cytb基因比對后，僅發(fā)現(xiàn)2個(gè)變異位點(diǎn)，說明Cytb基因在香魚種內(nèi)的變異很小，所以作者認(rèn)為其不適合作為種內(nèi)遺傳分析的標(biāo)記。而在D-loop區(qū)發(fā)現(xiàn)17個(gè)變異位點(diǎn)，說明香魚與其他脊椎動物一樣線粒體D-loop區(qū)的進(jìn)化速度較快。

據(jù)此分析，是否可以推測：Ctyb在遺傳變異顯著(或遺傳分化明顯)的群體中變異較大，更適合種間或以上階元系統(tǒng)進(jìn)化分析，而D-loop在遺產(chǎn)差異不顯著的群體中變異相對較大，適合同種不同地理居群的多樣性分析？

由于各種遺傳分析方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，因此在實(shí)踐應(yīng)用中，需根據(jù)研究材料、目的不同，選擇不同的分析方法，且最好是幾種方法同時(shí)運(yùn)用，將結(jié)果相互印證，以便使得到的結(jié)論更客觀，更真實(shí)。

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