劉陽 陳燕波 陳志民 常翠青

北京大學(xué)第三醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究所（北京 100191）

近年來，兒童青少年肥胖患病率迅猛增長，不僅對他們身心健康產(chǎn)生影響，還會對其成年后的健康產(chǎn)生危害[1-3]。研究表明，除不良生活方式外，常見基因突變或基因多態(tài)性 （single nucleotide polymorphism，SNP）在肥胖的流行中也發(fā)揮著重要作用[4,5]?；蚨鄳B(tài)性與體重之間關(guān)系的研究日益受到重視。

2005年，PLIN基因被納入為肥胖相關(guān)基因。人PLIN基因定位于15號染色體2區(qū)6帶1亞帶（15q26.1）[6]，一個與高血壓、高甘油三酯血癥及糖尿病發(fā)生有關(guān)的連鎖區(qū)內(nèi)[7,8]。PLIN編碼的脂滴包被蛋白Perilipin（又稱周脂素）是脂滴表面含量最多的一種可磷酸化蛋白，它對脂滴內(nèi)甘油三酯的儲存和動員具有關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[9]。目前發(fā)現(xiàn)，PLIN基因在生物體共有79個單核苷酸多態(tài)性，其中人類有76個。對PLIN基因多態(tài)性與人類肥胖的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PLIN 6209T>C、PLIN 11482G>A、PLIN 13041A>G和PLIN 14995A>T四個位點(diǎn)的SNPs可能與成人肥胖相關(guān)，且有種族和性別差異[10-12]。另有研究顯示，PLIN 11482G>A與運(yùn)動、飲食或藥物干預(yù)后體重的調(diào)節(jié)有關(guān)[13-15]。本研究以北京市200名肥胖中小學(xué)生為對象，初步探討PLIN基因多態(tài)性在中國漢族肥胖兒童青少年中的分布及其與BMI的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

通過門診招募廣告征集和健康體檢，篩選出200名10～17歲漢族肥胖兒童青少年，其中男生110名，年齡（14.8±1.8）歲；女生 90 名，年齡（14.7±1.7）歲。肥胖判斷依據(jù)“中國學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數(shù)值分類標(biāo)準(zhǔn)”[16]。所有受試者均無吸煙、飲酒史和減肥藥物使用史，排除心、肺、肝、腎等重要臟器疾病、身體發(fā)育異常、身體殘缺、畸形，以及內(nèi)分泌疾病、藥物副作用等引起的繼發(fā)性肥胖。本研究得到北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均自愿參加，受試者及其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 體格測量

采用立柱式身高坐高儀測定身高。受試者赤腳，立正，軀干自然挺直，頭部正直，足跟、骶骨及兩肩胛間三點(diǎn)與立柱相接觸，測量人員兩眼平視水平刻度，測量數(shù)據(jù)精確到0.1 cm；杠桿秤稱量體重，精確到0.1 kg。要求受試者空腹、脫鞋、只穿輕薄衣物。根據(jù)體重和身高計算BMI，單位為kg/m2。用MC-180身體成分分析儀 （Tanita公司）測量體脂百分比（FAT%）。

1.3 采集血樣標(biāo)本

清晨采集空腹肘靜脈血4 ml，EDTA抗凝，分離血漿和血細(xì)胞后，放入-80℃冰箱備用。

1.4 DNA提取和基因組測序

取-80℃凍存EDTA抗凝血細(xì)胞樣本0.5 ml，使用蛋白酶消化法提取DNA（天根生化科技公司血液基因組DNA提取試劑盒）。

使用Primary Primers 5.0分別設(shè)計PLIN 6209T>C（rs2289487）、PLIN 11482G>A（rs894160）和 PLIN 14995A>T（rs1052700）的引物，具體引物序列見表1。聚合酶鏈反應(yīng) （PCR）擴(kuò)增DNA，PCR反應(yīng)體系50 μl：其中 2×PCR mastermix × 25μl（天根生化科技公司），上下游引物各 10 μmol/L，模板 DNA1 μg，去離子水加至50 μl。擴(kuò)增反應(yīng)在Gene Amp PCR system 9700儀上進(jìn)行。 反應(yīng)參數(shù)分別為：94℃ 3 min；94℃30 s，69℃ 30 s （6209T>C）、59℃ 30 s （11482G>A）、60℃ 30 s （14995A>T），72℃ 3 min， 共 35 個循環(huán)；72℃7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)切膠純化后由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司使用ABI3730XL測序儀測序，用Chromas軟件分析測序結(jié)果。

表1 PLIN基因三個多態(tài)性位點(diǎn)的引物設(shè)計

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有資料均采用SPSS 17.0統(tǒng)計。符合或近似正態(tài)分布的計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。對基因位點(diǎn)分布情況進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗；采用Haploview進(jìn)行連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）分析，并計算出連鎖不平衡系數(shù)D和D’值。為進(jìn)一步分析PLIN基因多態(tài)性與體重及BMI的關(guān)系，分析由PLIN 6209T>C、PLIN 11482G>A和PLIN 14995A>T兩兩組合成的單倍型（haplotype），即兩個SNP罕見基因的攜帶者和非攜帶者，如6209C/11482A罕見基因CA的攜帶者 （同時攜帶PLIN 6209 CC／TC 和 PLIN 11482 GA／AA 的受試者為CA攜帶者）和非CA攜帶者。兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組之間的比較采用方差分析（ANOVA）。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，P<0.05被認(rèn)為所檢驗指標(biāo)有顯著性差別。

2 結(jié)果

2.1 受試者一般情況

表2顯示，受試者平均年齡14.8歲（10～17歲），無性別差異。身高、體重、BMI和體脂百分比的性別差異顯著（P<0.05），男生平均身高、體重和BMI均高于女生，F(xiàn)AT%小于女生。

表2 受試者體格測量指標(biāo)

表3 PLIN基因三個多態(tài)性位點(diǎn)在男女之間的基因型和頻率分布

2.2 PLIN基因多態(tài)性位點(diǎn)的頻率分布及Hardy-Weinberg平衡檢驗

表3顯示，在所有受試者中，PLIN 6209T>C、PLIN 11482G>A和PLIN 14995A>T的分布情況以及Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示，群體基因遺傳平衡，所選樣本均具有整體代表性 （P>0.05）。PLIN 6209T>C、PLIN 11482G>A 和 PLIN 14995A>T多態(tài)性罕見基因的頻率分別為 0.613、0.348和0.335?？ǚ綑z驗顯示男性和女性之間的PLIN基因多態(tài)性的基因型/頻率分布無顯著差異。

2.3 PLIN基因多態(tài)性位點(diǎn)連鎖不平衡檢驗

圖1中，左上方塊表示PLIN 6209T>C和PLIN 11482G>A之間的LD程度，右上方塊顯示PLIN 11482G>A和PLIN 14995A>T之間的LD程度，下面的方塊表示PLIN 6209T>C和PLIN 14995A>T之間的LD程度。在受試者中，PLIN 6209T>C和PLIN 11482G>A多態(tài)性強(qiáng)連鎖不平衡或緊密連鎖 （D’=0.923）。PLIN 6209T>C和 PLIN 11495A>T及 PLIN 11482G>A和PLIN 11495A>T輕度連鎖不平衡，D’值相對較低，分別為0.792和0.727。

圖1 PLIN 6209T>C（rs2289487）、PLIN 11482G>A（rs894160） 和 PLIN 14995A>T（rs1052700）3個SNP位點(diǎn)LD圖

2.4 PLIN基因多態(tài)性與體格測量指標(biāo)的關(guān)系

表4顯示，在所有受試者中，PLIN基因3個多態(tài)性（包括PLIN 6209T>C、11482G>A和14995A>T）各基因型攜帶者之間的體重、BMI及Fat%均無顯著性差異。按性別分類統(tǒng)計顯示，女性受試者中，PLIN基因3個多態(tài)性各基因型攜帶者之間的體格測量指標(biāo)無顯著性差異；而在男性受試者中，PLIN 11482G>A罕見基因攜帶者（GA+AA）BMI顯著高于常見基因（GG）攜帶者（P<0.05）。

表4 PLIN 11482G>A不同基因型體格測量指標(biāo)之間的比較

2.5 單倍型分析

表5顯示，在所有受試者中，2個SNP組合成的單倍型之間的體格測量指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異。按性別分類統(tǒng)計后，在單倍型PLIN 6209T>C/PLIN 11482G>A中，男性受試者中，罕見基因即CA單倍型攜帶者 （同時攜帶PLIN 6209 CC/TC和PLIN 11482 GA/AA的受試者）BMI顯著高于非CA攜帶者（P<0.05），其它無顯著差異。

表5 PLIN 6209T>C/PLIN 11482G>A單倍型體格測量指標(biāo)之間的比較

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在中國漢族肥胖兒童與青少年中，PLIN 6209T>C以罕見基因C多見，其頻率（0.613）高于巴西肥胖兒童青少年（0.48）[17]和中國漢族肥胖成人（0.556）[18]，高于韓國超重或肥胖成人（0.359）[19]和西班牙肥胖成人（0.34）[13]；PLIN 11482G>A 以常見基因G為主，其頻率（0.653）接近巴西肥胖兒童青少年（0.70）[17]，與中國肥胖成人（0.642）[18]及韓國肥胖成人（0.672）[19]相當(dāng)，低于西班牙肥胖成人（0.76）[13]；PLIN 14995A>T以常見基因A多見，其頻率（0.665）低于巴西肥胖兒童青少年（0.74）[17]，高于中國肥胖成人（0.612）[18]、韓國肥胖成人（0.616）[19]和西班牙肥胖成人（0.62）[13]。上述結(jié)果顯示，PLIN基因SNPs在肥胖者的分布頻率不僅存在種族差異，而且可能存在生理年齡差異，即PLIN基因SNPs在肥胖兒童青少年和肥胖成年人之間的分布頻率可能有差異。

對 PLIN 6209T>C、PLIN 11482G>A 和 PLIN 14995A>T三個位點(diǎn)與肥胖受試者體格測量指標(biāo)之間的關(guān)系分析顯示，PLIN 11482G>A罕見基因攜帶者 （GA+AA）BMI顯著高于常見基因GG攜帶者，罕見基因A可能與男性高BMI相關(guān)。Deram等[17]對234名巴西肥胖兒童青少年的研究也有類似發(fā)現(xiàn)，PLIN 6209T>C、PLIN 11482G>A 和 PLIN 14995A>T三個基因多態(tài)性位點(diǎn)與基線體重、腰圍及BMI等無明顯相關(guān)性，但PLIN 11482G>A罕見基因A攜帶者甘油三酯（TG）水平明顯較高，而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）明顯較低，且罕見基因A還與胰島素抵抗相關(guān)。這說明PLIN 11482G>A罕見基因A可能是肥胖兒童青少年及其相關(guān)代謝疾病的危險因素。一項有關(guān)日本中年男性的病例對照研究結(jié)果顯示，PLIN 11482G>A罕見基因A與高體重、高BMI及高腰圍相關(guān)，AA基因型攜帶者體重、BMI及腰圍均明顯高于其他基因型[20]。但在中國漢族肥胖成人[18]與西班牙肥胖成人[13]和普通人群[12]中，PLIN 11482罕見基因A可能是肥胖的保護(hù)因素，罕見基因A攜帶者 （GA+AA）BMI和腰圍均明顯較低[12,13]，特別是女性[12]。上述結(jié)果不一致除了種族差異外，可能與生活方式等環(huán)境因素有關(guān)[21,22]。有研究發(fā)現(xiàn)，碳水化合物攝入量較高（>144 g/d）的受試者，PLIN 11482罕見基因 A顯示是肥胖的保護(hù)因素，而攝入量較低者（<144 g/d），罕見基因A則增加肥胖發(fā)生的風(fēng)險[23]。

為了對PLIN基因多態(tài)性與體重及BMI的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)分析，根據(jù)連鎖不平衡的情況，將不同的多態(tài)性位點(diǎn)組合成單倍型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時攜帶PLIN 6209T>C和PLIN 11482G>A（2個SNP強(qiáng)連鎖，D’=0.923）罕見基因的男性受試者，即CA單倍型攜帶者BMI顯著高于非CA攜帶者。研究巴西肥胖兒童青少年中PLIN 11482G>A和PLIN 14995A>T組成的單倍型后發(fā)現(xiàn)，攜帶PLIN 11482罕見基因A的單倍型與肥胖相關(guān)的高血脂及代謝綜合征高風(fēng)險有關(guān)[17]。Qi等[10]研究了新加坡多民族的普通人群后發(fā)現(xiàn)，馬來裔和印裔中，攜帶PLIN 11482罕見基因A和PLIN 14995罕見基因T的單倍型（2個 SNP 強(qiáng)連鎖：馬來裔，D’=0.78；印度裔，D’=0.76）與肥胖高風(fēng)險相關(guān)。但在荷蘭超重或肥胖人群及西班牙、美國普通人群中，攜帶PLIN 6209罕見基因C和PLIN 11482罕見基因A單倍型 （2個SNP 強(qiáng)連鎖：荷蘭，D’>0.9；西班牙，D’=0.958；美國，D’=0.92）的受試者體重、BMI、腰圍、體脂肪和肥胖發(fā)生風(fēng)險均明顯較低，且有明顯的性別差異[11,12,24]。這說明PLIN基因多態(tài)性與肥胖的風(fēng)險關(guān)系還可能與不同人群連鎖不平衡的不同結(jié)構(gòu)有關(guān)。

本研究的局限性：雖然Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示群體基因遺傳平衡，所選總體樣本均具有整體代表性，但缺少正常體重兒童青少年的結(jié)果，因此有待增加正常兒童青少年P(guān)LIN基因檢測結(jié)果進(jìn)一步驗證。此外，PLIN基因多態(tài)性與肥胖相關(guān)代謝指標(biāo)之間的關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PLIN基因多態(tài)性可能與中國漢族肥胖兒童青少年BMI相關(guān)，男性兒童青少年中，PLIN 11482罕見等位基因A攜帶者發(fā)生肥胖的風(fēng)險可能高于GG基因型攜帶者。

［1］Ebbeling CB，Pawlak DB，Ludwig DS.Childhood obesity：public-health crisis，common sense cure.Lancet，2002，360（9331）：473-482.

［2］Kiess W，Reich A，Muller G，et al.Clinical aspects of obesity in childhood and adolescence--diagnosis，treatment and prevention.Int J Obes Relat Metab Disord，2001，25（Suppl 1）：S75-S79.

［3］Li YP，Ma GS，Schouten EG，et al.Report on childhood obesity in China （5） body weight，body dissatisfaction，and depression symptoms of Chinese children aged 9-10 years.Biomed Environ Sci，2007，20（1）：11-18.

［4］Ramachandrappa S，F(xiàn)arooqi IS.Genetic approaches to understanding human obesity.J Clin Invest，2011，121（6）：2080-2086.

［5］Nguyen DM，El-Serag HB.The epidemiology of obesity.Gastroenterol Clin North Am，2010，39（1）：1-7.

［6］Nishiu J，Tanaka T，Nakamura Y.Isolation and chromosomal mapping of the human homolog of perilipin （PLIN），a rat adipose tissue-specific gene，by differential display method.Genomics，1998，48（2）：254-257.

［7］Mori Y，Otabe S，Dina C，et al.Genome-wide search for type 2 diabetes in Japanese affected sib-pairs confirms susceptibility genes on 3q，15q，and 20q and identifies two new candidate Loci on 7p and 11p.Diabetes，2002，51（4）：1247-1255.

［8］Duggirala R，Blangero J，Almasy L，et al.A major susceptibility locus influencing plasma triglyceride concentrations is located on chromosome 15q in Mexican Americans.Am J Hum Genet，2000，66（4）：1237-1245.

［9］Tai ES，Ordovas JM.The role of perilipin in human obesity and insulin resistance.Curr Opin Lipidol，2007，18 （2）：152-156.

［10］Qi L，Tai ES，Tan CE，et al.Intragenic linkage disequilibrium structure of the human perilipin gene（PLIN）and haplotype association with increased obesity risk in a multiethnic Asian population.J Mol Med，2005，83（6）：448-456.

［11］Qi L，Shen H，Larson I，et al.Gender-specific association of a perilipin gene haplotype with obesity risk in a white population.Obes Res，2004，12（11）：1758-1765.

［12］Qi L，Corella D，Sorli JV，et al.Genetic variation at the perilipin （PLIN）locus is associated with obesity-related phenotypes in White women.Clin Genet，2004，66 （4）：299-310.

［13］Corella D，Qi L，Sorli JV，et al.Obese subjects carrying the 11482G>A polymorphism attheperilipin locusare resistant to weight loss after dietary energy restriction.J Clin Endocrinol Metab，2005，90（9）：5121-5126.

［14］KangES，ChaBS，Kim HJ，etal.The11482G >A polymorphism in the perilipin gene is associated with weightgain with rosiglitazone treatmentin type 2 diabetes.Diabetes Care，2006，29（6）：1320-1324.

［15］姜雪，黃志卓，常翠青.Plin基因11482 G/A單核苷酸多態(tài)性與漢族肥胖青少年有氧鍛煉前后BMI變化關(guān)系.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2008，28（6）：719-722.

［16］中國肥胖問題工作組，季成葉.中國學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數(shù)值分類標(biāo)準(zhǔn).中華流行病學(xué)雜志，2004（2）：97-102.

［17］Deram S，Nicolau CY，Perez-Martinez P，et al.Effects of perilipin （PLIN） gene variation on metabolic syndrome risk and weight loss in obese children and adolescents.J Clin Endocrinol Metab，2008，93（12）：4933-4940.

［18］陳燕波，常翠青，黃志卓，等.PLIN基因多態(tài)性在中國漢族成年肥胖者中的分布.營養(yǎng)學(xué)報，2011，（1）：29-33.

［19］Jang Y，Kim OY，Lee JH，et al.Genetic variation at the perilipin locus is associated with changes in serum free fatty acids and abdominal fat following mild weight loss.Int J Obes（Lond），2006，30（11）：1601-1608.

［20］Sone Y，Yamaguchi K，F(xiàn)ujiwara A，et al.Association of lifestyle factors，polymorphisms in adiponectin，perilipin and hormone sensitive lipase，and clinical markers in Japanese males.J Nutr Sci Vitaminol （Tokyo），2010，56（2）：123-131.

［21］Ordovas JM.Gender，a significant factor in the cross talk between genes，environment，and health.Gend Med，2007，4（Suppl B）：S111-S122.

［22］Korkeila M，Kaprio J，Rissanen A，et al.Effects of gender and age on the heritability of body mass index.Int J Obes，1991，15（10）：647-654.

［23］Smith CE，Tucker KL，Yiannakouris N，et al.Perilipin polymorphism interacts with dietary carbohydrates to modulate anthropometric traits in hispanics of Caribbean origin.J Nutr，2008，138（10）：1852-1858.

［24］Soenen S，Mariman EC，Vogels N，et al.Relationship between perilipin gene polymorphisms and body weight and body composition during weight loss and weight maintenance.Physiol Behav，2009，96（4-5）：723-728.