全局調(diào)控基因?qū)股厣锖铣傻挠绊?/h1>
2012-05-30 05:13陳艷萍趙春田裘娟萍
浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年7期
陳艷萍，趙春田，裘娟萍
(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)
鏈霉菌是一類具有分枝狀菌絲體的好氧性革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，它們具有復(fù)雜的形態(tài)分化和次級(jí)代謝過程，能產(chǎn)生多種類型的具有重要應(yīng)用價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物。例如，用于抗家畜寄生蟲及殺螨蟲的阿維菌素 (avermectin)，防治西紅柿青枯病的鏈霉素(streptomycin)，用于獸藥的四環(huán)素 (tetracycline)，用于飼料添加劑的默諾霉素 (moenomycin)等。隨著人們對(duì)藥物需求的日益增加，鏈霉菌生產(chǎn)抗生素的研究也突顯其重要性。在這些抗生素合成過程中存在龐大而復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng):途徑特異性調(diào)控因子主要參與特定的抗生素的生物合成過程;全局多效調(diào)控因子不僅調(diào)控多種抗生素的產(chǎn)生，還參與鏈霉菌的形態(tài)分化。
全局性調(diào)控基因一般位于抗生素生物合成基因簇之外，調(diào)控相應(yīng)途徑特異性基因的表達(dá)。相對(duì)于鏈霉菌次級(jí)代謝中的其他調(diào)控模式而言，全局調(diào)控是一種更為多樣、普遍、復(fù)雜的調(diào)控模式。全局調(diào)控基因可以調(diào)控多條次級(jí)代謝途徑，對(duì)磷酸鹽或者氮源匱乏、細(xì)胞壁損壞、熱休克、pH壓力等環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)脅迫信號(hào)做出反應(yīng)［1-2］。根據(jù)參與調(diào)控的基因的數(shù)量通常可以將全局調(diào)控基因分為孤立響應(yīng)調(diào)控 (orphan response regulate)基因和雙組分調(diào)控系統(tǒng) (two-component systems，TCSs)基因。本文以鏈霉菌模式生物天藍(lán)色鏈霉菌 (Streptomyces coelicolor)的全局調(diào)控基因?yàn)閰⒖?，就近年?lái)鏈霉菌中抗生素生物合成全局調(diào)控的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為利用基因工程手段提高抗生素的產(chǎn)量或?qū)ζ溥M(jìn)行結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù)。
1 孤立響應(yīng)調(diào)控基因
孤立響應(yīng)調(diào)控基因通常為單個(gè)基因，調(diào)控抗生素的生物合成。目前所發(fā)現(xiàn)的孤立響應(yīng)基因眾多，本文主要對(duì)以下幾種研究得比較清楚的孤立響應(yīng)調(diào)控基因作詳細(xì)介紹 (表1)。
1.1 atrA
2005年，Uguru 等［3］在 S.coelicolor A3(2)中發(fā)現(xiàn)一種新的TetR家族的ActⅡ-ORF4的激活因子，命名為atrA(actinorhodin-associated transcriptional regulator)。Hong 等［4］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，atrA不僅可結(jié)合到 actⅡ-orf4的啟動(dòng)子區(qū)，還可結(jié)合到灰色鏈霉菌 (Streptomyces griseus)途徑特異性調(diào)控基因 strR的啟動(dòng)子，將 atrA導(dǎo)入 S.griseus后可引起鏈霉素產(chǎn)量下降。Hirano等［5］發(fā)現(xiàn)S.griseus中atrA基因表達(dá)的AtrA蛋白在某些特定的培養(yǎng)條件下對(duì)鏈霉素的生物合成起正調(diào)控作用。最近，Chen等［6］在對(duì)阿維菌素的代謝途徑進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其基因組上也存在單拷貝的atrA同源基因aveI，該基因被阻斷后，阿維菌素的主要組分Bla的產(chǎn)量升高，而在 aveI的回復(fù)突變株中，Bla的產(chǎn)量與野生菌相比又明顯下降，表明aveI對(duì)阿維菌素的生物合成起負(fù)調(diào)控作用;將aveI多拷貝質(zhì)粒導(dǎo)入 S.coelicolor中，放線紫紅素 (actinorhodin，Act)產(chǎn)量明顯增加，說(shuō)明 aveI對(duì) S.coelicolor中Act的生物合成起正調(diào)控作用。李光偉等［7］在力達(dá)霉素 (lidamycin)產(chǎn)生菌球孢鏈霉菌 (Streptomyces globisporus)C-1027中克隆到atrA同源基因。綜上所述，atrA因菌株培養(yǎng)條件不同或?qū)匍g差異對(duì)抗生素的合成起正調(diào)控或負(fù)調(diào)控作用。
表1 鏈霉菌孤立調(diào)控基因及其功能
1.2 bldA
bldA基因又稱“光禿”基因，是目前研究最透徹的形態(tài)分化調(diào)控基因之一，編碼鏈霉菌基因組中唯一能有效識(shí)別稀有TTA密碼的tRNA。bldA阻斷突變菌株不能形成氣生菌絲和孢子，而表現(xiàn)為“光禿”表型［8］，“光禿”基因的名字也由此得來(lái)。測(cè)序完成的S.coelicolor基因組顯示，其中145個(gè)含有TTA密碼子的基因作為bldA潛在靶基因，構(gòu)成了由bldA控制的龐大而復(fù)雜的基因調(diào)控元，因此鏈霉菌中，bldA基因在多水平級(jí)聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。S.coelicolor Act生物合成途徑中，bldA通過控制含TTA密碼子的途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4和抗生素產(chǎn)物輸出調(diào)控基因 actⅡ-orf2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)抗生素合成［9］。依賴 bldA調(diào)控抗生素合成的現(xiàn)象在其他鏈霉菌中也普遍存在，如白黑鏈霉菌 (Streptomyces alboniger)、S.griseus和變鉛青鏈霉菌 (Streptomyces lividans)也都存在bldA通過控制含TTA密碼子基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)孢子產(chǎn)生和抗生素合成［10-11］。陶韋新等［12］通過阻斷阿維鏈霉菌 (S.avermitilis)NRRL 8165中 bldA基因，發(fā)現(xiàn)突變株喪失合成阿維菌素的能力，提示阿維菌素的合成受bldA調(diào)控;由于阿維菌素生物合成基因簇中aveA3和aveR含有TTA密碼子，推斷其翻譯可能受bldA的調(diào)控。
1.3 nsdA和nsdB
nsdA (negative regulator of streptomyces differenti-ation)基因是最早在 S.coelicolor中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)全局性調(diào)控基因，含有三十四肽重復(fù)單位(tetratrico peptide repeat，TPR)結(jié)構(gòu)，對(duì)其產(chǎn)孢、形態(tài)分化、抗生素的合成均有負(fù)調(diào)控作用。余貞等［13］進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，nsdA是保守存在于多種鏈霉菌中的全局性負(fù)調(diào)控基因，對(duì)鏈霉菌形態(tài)分化和抗生素的合成均具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，阻斷nsdA基因可大大提高抗生素產(chǎn)量。例如，S.coelicolor A3(2)中nsdA基因的阻斷，引起Act、鈣依賴性抗生素 (calcium-dependent antibiotic，CDA)和次甲霉素 (methylenomycin，Mmy)超量產(chǎn)生，且產(chǎn)孢量也是野生型的2倍;S.avermitilis NRRL 8165中，nsdA基因的阻斷導(dǎo)致阿維菌素的產(chǎn)量提高了3～5倍;井岡霉素 (validamycin)產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008、鹽霉素(salinomycin)產(chǎn)生菌白色鏈霉菌 (Streptomyces albus)和慶豐霉素 (qingfengmycin)產(chǎn)生菌慶豐鏈霉菌 (Streptomyces qingfengmyceticus)等多種鏈霉菌中也發(fā)現(xiàn)有nsdA同源基因;陳芬等［14］阻斷肉桂地鏈霉菌 (Streptomyces cinnamoncnsis)中的nsdA基因后，莫能菌素 (monensin)的產(chǎn)量提高了2.7倍。郭鎖蓮等［15］等通過基因阻斷冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchenggensis)226541中的nsdA基因，發(fā)現(xiàn)米爾貝霉素 (milbemycins)和南昌霉素(nanchangmycin)的產(chǎn)量分別提高了1.5和9倍。nsdA的廣泛存在為抗生素生產(chǎn)菌高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供了新的靶標(biāo)。
研究發(fā)現(xiàn)，同樣來(lái)自于 S.coelicolor的 nsdB(SCO7252)也編碼TPR結(jié)構(gòu)的蛋白，阻斷nsdB基因使菌株的Act和CDA產(chǎn)量均提高，但形態(tài)分化沒有明顯變化［16］。含有 TPR結(jié)構(gòu)域蛋白的具體作用機(jī)制還不清楚，該蛋白是如何表達(dá)、如何影響別的基因以致最終影響到形態(tài)分化和次級(jí)代謝的，這些問題都尚未闡明，或許是一種影響鏈霉菌分化的新模式。
1.4 relA
在某些重要的營(yíng)養(yǎng)成分缺乏 (如氨基酸)時(shí)，細(xì)菌對(duì)某些基因和酶的表達(dá)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)控制，稱為嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng) (stringent response)。嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是細(xì)菌適應(yīng)不利環(huán)境的一種調(diào)控方式。許多研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)依賴于焦磷酸鳥苷酸 (p)ppGpp的瞬時(shí)增加，當(dāng)空載的tRNA結(jié)合到核糖體的A位點(diǎn)時(shí)，四磷酸鳥苷酸合成酶基因relA編碼的蛋白催化 (p)ppGpp合成，(p)ppGpp的合成增加激活抗生素的合成。在大腸桿菌 (Escherichia coli)中人們發(fā)現(xiàn)(p)ppGpp能夠改變RNA聚合酶對(duì)σ因子的選擇性，這說(shuō)明了 (p)ppGpp調(diào)控的靶點(diǎn)是 RNA聚合酶。當(dāng)RNA聚合酶β亞基利福平 (rifampicin)結(jié)合域上某個(gè)位點(diǎn)突變后， (p)ppGpp對(duì)抗生素合成的直接調(diào)控作用消失了，提示這個(gè)位點(diǎn)可能靠近或者就是 (p)ppGpp結(jié)合RNA聚合酶的位點(diǎn)［17］，(p)ppGpp結(jié)合RNA聚合酶后，使后者的構(gòu)象改變利于抗生素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄［18］。在鏈霉菌中，relA的敲除表現(xiàn)為氮源缺陷條件下抗生素合成的缺陷，研究也證實(shí)了 S.coelicolor中relA敲除突變株中抗生素合成基因轉(zhuǎn)錄水平下降，以及抗生素合成途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4和redD的轉(zhuǎn)錄明顯下調(diào)［19］。Gomez-Escribano 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，阻斷棒狀鏈霉菌 (Streptomyces clavuligerus)relA基因，使其不能形成氣生菌絲且不能產(chǎn)生孢子，克拉維酸 (clavulanic acid)和頭霉素 C(cephamycinC)的產(chǎn)量顯著增加。最近，Makitrynskyy等［21］將 S.coelicolor中 relA 基因?qū)爰蛹{鏈霉菌 (Streptomyces ghanaensis)ATCC 14672中異源過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)默諾霉素產(chǎn)量增加了2倍。
1.5 rrdA
rrdA(regulator of redD)基因編碼TetR家族蛋白，在 S.coelicolor中被發(fā)現(xiàn)，隨后依次在 S.avermitilis、產(chǎn)二素鏈霉菌 (Streptomyces ambofaciens)ATCC 23877等鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)有同源基因。S.coelicolor rrdA阻斷突變株顯示 Red產(chǎn)量增加而 Act產(chǎn)量降低，將 rrdA多拷貝質(zhì)粒導(dǎo)入 S.coelicolor中過量表達(dá)導(dǎo)致Red產(chǎn)量大大降低而Act高產(chǎn);反轉(zhuǎn)錄PCR顯示RrdA通過阻遏redD mRNA的合成負(fù)調(diào)控Red的生物合成，但Act途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生變化，說(shuō)明RrdA對(duì)Act在轉(zhuǎn)錄水平上沒有起正調(diào)控作用，可能通過與Act和Red合成途徑的共同前體競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控 Act的生物合成［22］。
1.6 sig6
鏈霉菌中的ECFσ因子能快速、準(zhǔn)確地調(diào)控不同的壓力應(yīng)答調(diào)控子以適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境。目前，僅有一部分ECFσ因子因其在形態(tài)分化和次級(jí)代謝的調(diào)控作用而被廣泛關(guān)注［23-25］。sig6(SAV663)存在于 S.avermitilis中，編碼 RNA聚合酶 ECFσ因子，敲除該基因后，阿維菌素的產(chǎn)量增加了2.0～2.7倍，但對(duì)S.avermitilis的生長(zhǎng)和形態(tài)無(wú)明顯影響;將含多拷貝sig6基因的質(zhì)粒導(dǎo)入S.avermitilis野生菌株后，阿維菌素的產(chǎn)量降低。說(shuō)明Sig6對(duì)S.avermitilis的阿維菌素起負(fù)調(diào)控作用［26］。RT-PCR分析證明，Sig6通過途徑特異性調(diào)控基因aveR調(diào)控阿維菌素的生物合成，這為通過改變ECFσ因子的活力增加鏈霉菌抗生素的產(chǎn)量開辟途徑。
1.7 ssgA
ssgA(sporulation-specific cell division)基因在S.coelicolor中過量表達(dá)導(dǎo)致 Red產(chǎn)量增加2～5倍，但Act的生物合成完全受阻［27］。S.coelicolor中Red生成的時(shí)間比 Act早，ssgA將 S.coelicolor的生理狀態(tài)控制在Red生成期，阻止其進(jìn)入Act生成期。因此，ssgA可能代表另外一種協(xié)調(diào)抗生素生物合成與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的新的重要模式［28］。由于ssgA對(duì)一些抗生素生物合成的正調(diào)控作用，現(xiàn)被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)菌株上，如van Wezel等［29］通過過量表達(dá)S.lividans中 ssgA基因，導(dǎo)致其次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量增加2.5倍，S.coelicolor中 ssgA過量表達(dá)導(dǎo)致Red產(chǎn)量增加近10倍。因此，ssgA的過量表達(dá)為抗生素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供一種有效途徑。
1.8 wblA
wblA(WhiB-like transcription factor)基因首先于S.coelicolor中被發(fā)現(xiàn)，編碼 WhiB家族蛋白的同源物。其過量表達(dá)抑制 Act、Red和 CDA的合成，且不能產(chǎn)生孢子［30-31］。Noh 等［32］利用種間DNA微矩陣分析 (Interspecies DNA Microarray Analysis)發(fā)現(xiàn)波賽鏈霉菌 (Streptomyces peucetius)中也存在 wblA基因 (wblAspe)。阻斷 wblAspe導(dǎo)致阿霉素 (doxorubicin)道諾霉素 (doxorubucin)產(chǎn)量增加7倍。Rabyk等［33］在已測(cè)序的 S.ghanaensis中鑒定了 wblAgh基因，阻斷該基因發(fā)現(xiàn) S.ghanaensis氣生菌絲不能產(chǎn)生孢子，且默諾霉素的產(chǎn)量增加了2.3倍，說(shuō)明S.ghanaensis中的wblAgh基因和wblAsco、wblAspe一樣，負(fù)調(diào)控抗生素的生物合成，且與形態(tài)分化有關(guān)。
2 雙組分調(diào)控基因
在鏈霉菌中，雙組分調(diào)控系統(tǒng)是一類非常重要的全局調(diào)控系統(tǒng)，參與胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)、新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)分化等多種生理代謝過程，尤其與鏈霉菌復(fù)雜的形態(tài)分化和抗生素合成的調(diào)控有著密切的關(guān)系。本文就以下4種雙組分調(diào)控系統(tǒng)基因作詳細(xì)介紹 (表2)。
表2 鏈霉菌中雙組分調(diào)控系統(tǒng)基因及其功能
2.1 absA1-absA2
AbsA1-AbsA2(SCO3225-SCO3226)是S.coelicolor中研究得最為清楚的一對(duì)雙組分調(diào)控系統(tǒng)。absA1-absA2基因位于鈣依賴性抗生素(CDA)生物合成基因簇內(nèi)部，敲除S.coelicolor中absA1和absA2基因，證明了AbsA雙組分系統(tǒng)負(fù)調(diào)控Act、Red和CDA的合成［34］。轉(zhuǎn)錄分析顯示，AbsA1-AbsA2主要是通過影響途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4和redD的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控Act和Red的合成。而對(duì)于CDA生物合成的調(diào)控，是通過調(diào)控與CDA生物合成相關(guān)的多肽合成酶的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。AbsA1感應(yīng)外界環(huán)境變化并轉(zhuǎn)為激酶形式，對(duì)自身保守的組氨酸殘基磷酸化進(jìn)行自體激活，然后將自身的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到應(yīng)答調(diào)節(jié)子AbsA2保守的天冬氨酸殘基上，磷酸化的應(yīng)答調(diào)節(jié)子AbsA2再有力地結(jié)合到DNA的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控轉(zhuǎn)錄。當(dāng)外界信號(hào)消失或被降解，AbsA抑制被解除，AbsA1轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崦感问?，將AbsA2去磷酸化，抗生素合成基因表達(dá)［35］。將absA1的等位基因?qū)隨treptomyces flavopersicus異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抗菌類物質(zhì)粉霉素(pulvomycin)的沉默基因被激活［36］。因此，AbsA雙組分調(diào)控系統(tǒng)的多效調(diào)控被廣泛應(yīng)用于開發(fā)新的抗菌物質(zhì)。
2.2 afsR-afsK
AfsR屬于STAND家族蛋白，由afsR基因編碼，N端有OmpR家族的兩個(gè)特征結(jié)構(gòu)域 (DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)，同時(shí)還含有結(jié)合ATP的保守motif，在其C端有TPR結(jié)構(gòu)域。通過磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，AfsR可以同時(shí)對(duì)多種抗生素的合成進(jìn)行調(diào)控。AfsK與細(xì)胞膜連接，感應(yīng)外界特定的環(huán)境信號(hào)，將自身蘇氨酸和絲氨酸殘基磷酸化，以增加其激酶活力［37］。細(xì)胞膜上被激活的AfsK催化磷酸化細(xì)胞質(zhì)中AfsR的蘇氨酸殘基和絲氨酸殘基，極大地增強(qiáng)了AfsR與DNA的結(jié)合能力［38］。AfsR-P結(jié)合到位于 afsR下游 afsS的啟動(dòng)子-35區(qū)域并激活它的轉(zhuǎn)錄，afsS編碼由63個(gè)氨基酸組成的蛋白AfsS，以未知方式正調(diào)控途徑特異性基因actⅡ-orf4、redD和cdaR，從而增加 Act、Red和CDA的產(chǎn)量［39-40］。afsR基因失活突變導(dǎo)致 S.coelicolor中 Act、CDA的產(chǎn)量明顯下降，導(dǎo)入 S.lividans中能促進(jìn)原本沉默的Act和Red的合成［41］。AfsK磷酸化AfsR的能力由afsK上游基因的編碼產(chǎn)物KbpA調(diào)節(jié)，當(dāng)KbpA與AfsK結(jié)合時(shí)，AfsK的激酶活力被抑制并阻止AfsR的磷酸化［42］。
在S.peucetius中也發(fā)現(xiàn)了AfsR的結(jié)構(gòu)類似物AfsR-p，當(dāng)其克隆到外源質(zhì)粒上ermE啟動(dòng)子下游并導(dǎo)入S. peucetius、 S. lividans TK24、 S.clavuligerus、S.griseus表達(dá)時(shí)，相應(yīng)的道諾霉素、Act、克拉維酸、鏈霉素分別提高了4倍、2.6倍、1.5 倍和略有提高［43］。
afsS啟動(dòng)子區(qū)是AfsR的結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)同時(shí)又是一個(gè)潛在的 PHO box。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)和DNA足跡實(shí)驗(yàn) (DNA footprinting assay)的結(jié)果驗(yàn)證了PhoP和AfsR在afsS基因啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別序列是重合的;體外結(jié)合試驗(yàn)證明了PhoP和AfsR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合afsS啟動(dòng)子區(qū)，AfsR同時(shí)能夠結(jié)合PhoP調(diào)控的基因，如pstS和phoR/phoP的啟動(dòng)子區(qū);報(bào)告基因 luxAB實(shí)驗(yàn)證實(shí) PhoP可下調(diào) afsS的表達(dá)，AfsR可下調(diào) pstS和 phoR/phoP的表達(dá)［44］。這表明PhoP和AfsR這兩個(gè)全局調(diào)控因子之間存在復(fù)雜的相互交叉作用。
2.3 cutS-cutR
CutS-CutR(SCO5863-SCO5862)是鏈霉菌中第1個(gè)被鑒定的雙組分調(diào)控系統(tǒng)［45］。迄今為止，多種鏈霉菌中均有報(bào)道該雙組分調(diào)控系統(tǒng)的存在。插入突變實(shí)驗(yàn)顯示，CutR-CutS的基因阻斷會(huì)引起S.lividans抗生素Act的過量生成;而當(dāng)CutR-CutS在S.coelicolor中過量表達(dá)時(shí)，Act的生物合成明顯被抑制，因此與AbsA1-AbsA2一樣，CutR-CutS對(duì)抗生素Act的生物合成也起負(fù)調(diào)控作用［46］。
2.4 phoR-phoP
磷酸鹽是活細(xì)胞的重要組成成分，其重要作用及其在自然界中的缺乏使得細(xì)菌進(jìn)化出多種應(yīng)對(duì)磷酸鹽缺乏的機(jī)制，這些機(jī)制導(dǎo)致細(xì)菌能夠適應(yīng)貧磷酸鹽的環(huán)境。能夠響應(yīng)磷酸鹽濃度變化的蛋白共同組成一個(gè)家族，稱為 Pho調(diào)控子 (phosphate regulon)，PhoR-PhoP及其所調(diào)控基因編碼的產(chǎn)物均屬于PHO調(diào)控子家族［47］。該調(diào)控子家族成員的序列具有共同特征，即在其啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)PHO box序列。低磷酸鹽濃度一直被認(rèn)為能夠刺激抗生素和其他次級(jí)代謝物的產(chǎn)生，包括了鏈霉素、四環(huán)素等［48］。在 E.coli中低磷酸鹽濃度傳遞的信號(hào)首先使得感應(yīng)器激酶 (PhoR)自我磷酸化，然后PhoR又將這個(gè)磷酸基團(tuán)傳遞到相應(yīng)調(diào)控蛋白(PhoP)的一個(gè)N端天冬氨酸殘基上，導(dǎo)致PhoP與其調(diào)控基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力大大提高，增強(qiáng)了這些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，PhoP的結(jié)合位點(diǎn)一般就是PHO box序列。在S.lividans中敲除 PhoR-PhoP雙組分系統(tǒng)基因的突變株表現(xiàn)出堿性磷酸酶 (AP)活性的降低和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的減少，同時(shí)Act和Red的大量產(chǎn)生，且無(wú)論在高磷酸鹽還是低磷酸鹽情況下產(chǎn)生Act和Red的能力均高于野生型菌株，說(shuō)明PhoR-PhoP雙組分系統(tǒng)抑制了抗生素的產(chǎn)生［49］。
2.5 rapA1-rapA2
2007年，Lu等［50］在 S.coelicolor中發(fā)現(xiàn)了一新的TCS，命名為RapA1-RapA2(regulation of both actinorhodin and a typeⅠ polyketide)，調(diào)控 Act和Ⅰ型聚酮化合物的生物合成。敲除rapA1-rapA2基因后，其生長(zhǎng)和形態(tài)與野生菌株M145相比沒有差異，但是Act和Ⅰ型聚酮化合物的產(chǎn)量明顯降低。其作用模式與absA1-absA2類似，通過影響途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4和kasO的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控Act和Ⅰ型聚酮化合物的合成，但其對(duì)Act和Ⅰ型聚酮化合物的調(diào)控可能代表 S.coelicolor中一種新的調(diào)控途徑。
2.6 abrA1-abrA2
2011年，Yepes等［51］在 S.coelicolor M145 中發(fā)現(xiàn)一種新的雙組分調(diào)控基因 abrA1-abrA2(antibiotic rugulator)，敲除該基因后，Act、Red和CDA的產(chǎn)量高于野生型菌株，且不產(chǎn)孢子，說(shuō)明abrA1-abrA2負(fù)調(diào)控抗生素的生物合成和形態(tài)分化。
3 小結(jié)與展望
鏈霉菌抗生素生物合成全局調(diào)控的顯著特點(diǎn)之一就是它的多樣性和復(fù)雜性。不同的基因應(yīng)答不同的環(huán)境、生理信號(hào)和一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)介導(dǎo)的外界壓力。全局調(diào)控基因多效調(diào)控多種抗生素的生物合成，大部分是以層層級(jí)聯(lián)的方式間接調(diào)控，只有AbsA1-AbsA2和rapA1-rapA2等少數(shù)效應(yīng)因子直接作用于抗生素合成途徑中的途徑特異性調(diào)控基因。不同調(diào)控基因之間也存在著交叉作用，導(dǎo)致抗生素生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜。要將復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究透徹是一個(gè)巨大的工程。目前，全基因組測(cè)序、全基因組微距陣、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因表達(dá)的時(shí)間-空間分析的發(fā)展，為理清調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜關(guān)系提供了有效的手段。
加強(qiáng)對(duì)農(nóng)用抗生素生物合成全局調(diào)控的研究，將加速構(gòu)建新農(nóng)藥產(chǎn)生菌或抗生素高產(chǎn)菌株的研究過程。默諾霉素作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑而廣泛應(yīng)用于飼料添加劑，作者以relA和nsdA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用基因工程手段阻斷這兩個(gè)基因的編碼，研究其對(duì)斑伯鏈霉菌 (Streptomyces bambergiensis)和加納鏈霉菌 (Streptomyces ghanaensis)中默諾霉素的產(chǎn)量及形態(tài)分化的影響，為進(jìn)一步闡明次級(jí)代謝和形態(tài)分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定一定基礎(chǔ)。
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陳艷萍，趙春田，裘娟萍
(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)
鏈霉菌是一類具有分枝狀菌絲體的好氧性革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，它們具有復(fù)雜的形態(tài)分化和次級(jí)代謝過程，能產(chǎn)生多種類型的具有重要應(yīng)用價(jià)值的次級(jí)代謝產(chǎn)物。例如，用于抗家畜寄生蟲及殺螨蟲的阿維菌素 (avermectin)，防治西紅柿青枯病的鏈霉素(streptomycin)，用于獸藥的四環(huán)素 (tetracycline)，用于飼料添加劑的默諾霉素 (moenomycin)等。隨著人們對(duì)藥物需求的日益增加，鏈霉菌生產(chǎn)抗生素的研究也突顯其重要性。在這些抗生素合成過程中存在龐大而復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng):途徑特異性調(diào)控因子主要參與特定的抗生素的生物合成過程;全局多效調(diào)控因子不僅調(diào)控多種抗生素的產(chǎn)生，還參與鏈霉菌的形態(tài)分化。
全局性調(diào)控基因一般位于抗生素生物合成基因簇之外，調(diào)控相應(yīng)途徑特異性基因的表達(dá)。相對(duì)于鏈霉菌次級(jí)代謝中的其他調(diào)控模式而言，全局調(diào)控是一種更為多樣、普遍、復(fù)雜的調(diào)控模式。全局調(diào)控基因可以調(diào)控多條次級(jí)代謝途徑，對(duì)磷酸鹽或者氮源匱乏、細(xì)胞壁損壞、熱休克、pH壓力等環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)脅迫信號(hào)做出反應(yīng)［1-2］。根據(jù)參與調(diào)控的基因的數(shù)量通常可以將全局調(diào)控基因分為孤立響應(yīng)調(diào)控 (orphan response regulate)基因和雙組分調(diào)控系統(tǒng) (two-component systems，TCSs)基因。本文以鏈霉菌模式生物天藍(lán)色鏈霉菌 (Streptomyces coelicolor)的全局調(diào)控基因?yàn)閰⒖?，就近年?lái)鏈霉菌中抗生素生物合成全局調(diào)控的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為利用基因工程手段提高抗生素的產(chǎn)量或?qū)ζ溥M(jìn)行結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù)。
1 孤立響應(yīng)調(diào)控基因
孤立響應(yīng)調(diào)控基因通常為單個(gè)基因，調(diào)控抗生素的生物合成。目前所發(fā)現(xiàn)的孤立響應(yīng)基因眾多，本文主要對(duì)以下幾種研究得比較清楚的孤立響應(yīng)調(diào)控基因作詳細(xì)介紹 (表1)。
1.1 atrA
2005年，Uguru 等［3］在 S.coelicolor A3(2)中發(fā)現(xiàn)一種新的TetR家族的ActⅡ-ORF4的激活因子，命名為atrA(actinorhodin-associated transcriptional regulator)。Hong 等［4］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，atrA不僅可結(jié)合到 actⅡ-orf4的啟動(dòng)子區(qū)，還可結(jié)合到灰色鏈霉菌 (Streptomyces griseus)途徑特異性調(diào)控基因 strR的啟動(dòng)子，將 atrA導(dǎo)入 S.griseus后可引起鏈霉素產(chǎn)量下降。Hirano等［5］發(fā)現(xiàn)S.griseus中atrA基因表達(dá)的AtrA蛋白在某些特定的培養(yǎng)條件下對(duì)鏈霉素的生物合成起正調(diào)控作用。最近，Chen等［6］在對(duì)阿維菌素的代謝途徑進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，其基因組上也存在單拷貝的atrA同源基因aveI，該基因被阻斷后，阿維菌素的主要組分Bla的產(chǎn)量升高，而在 aveI的回復(fù)突變株中，Bla的產(chǎn)量與野生菌相比又明顯下降，表明aveI對(duì)阿維菌素的生物合成起負(fù)調(diào)控作用;將aveI多拷貝質(zhì)粒導(dǎo)入 S.coelicolor中，放線紫紅素 (actinorhodin，Act)產(chǎn)量明顯增加，說(shuō)明 aveI對(duì) S.coelicolor中Act的生物合成起正調(diào)控作用。李光偉等［7］在力達(dá)霉素 (lidamycin)產(chǎn)生菌球孢鏈霉菌 (Streptomyces globisporus)C-1027中克隆到atrA同源基因。綜上所述，atrA因菌株培養(yǎng)條件不同或?qū)匍g差異對(duì)抗生素的合成起正調(diào)控或負(fù)調(diào)控作用。
表1 鏈霉菌孤立調(diào)控基因及其功能
1.2 bldA
bldA基因又稱“光禿”基因，是目前研究最透徹的形態(tài)分化調(diào)控基因之一，編碼鏈霉菌基因組中唯一能有效識(shí)別稀有TTA密碼的tRNA。bldA阻斷突變菌株不能形成氣生菌絲和孢子，而表現(xiàn)為“光禿”表型［8］，“光禿”基因的名字也由此得來(lái)。測(cè)序完成的S.coelicolor基因組顯示，其中145個(gè)含有TTA密碼子的基因作為bldA潛在靶基因，構(gòu)成了由bldA控制的龐大而復(fù)雜的基因調(diào)控元，因此鏈霉菌中，bldA基因在多水平級(jí)聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。S.coelicolor Act生物合成途徑中，bldA通過控制含TTA密碼子的途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4和抗生素產(chǎn)物輸出調(diào)控基因 actⅡ-orf2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)抗生素合成［9］。依賴 bldA調(diào)控抗生素合成的現(xiàn)象在其他鏈霉菌中也普遍存在，如白黑鏈霉菌 (Streptomyces alboniger)、S.griseus和變鉛青鏈霉菌 (Streptomyces lividans)也都存在bldA通過控制含TTA密碼子基因表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)孢子產(chǎn)生和抗生素合成［10-11］。陶韋新等［12］通過阻斷阿維鏈霉菌 (S.avermitilis)NRRL 8165中 bldA基因，發(fā)現(xiàn)突變株喪失合成阿維菌素的能力，提示阿維菌素的合成受bldA調(diào)控;由于阿維菌素生物合成基因簇中aveA3和aveR含有TTA密碼子，推斷其翻譯可能受bldA的調(diào)控。
1.3 nsdA和nsdB
nsdA (negative regulator of streptomyces differenti-ation)基因是最早在 S.coelicolor中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)全局性調(diào)控基因，含有三十四肽重復(fù)單位(tetratrico peptide repeat，TPR)結(jié)構(gòu)，對(duì)其產(chǎn)孢、形態(tài)分化、抗生素的合成均有負(fù)調(diào)控作用。余貞等［13］進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，nsdA是保守存在于多種鏈霉菌中的全局性負(fù)調(diào)控基因，對(duì)鏈霉菌形態(tài)分化和抗生素的合成均具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，阻斷nsdA基因可大大提高抗生素產(chǎn)量。例如，S.coelicolor A3(2)中nsdA基因的阻斷，引起Act、鈣依賴性抗生素 (calcium-dependent antibiotic，CDA)和次甲霉素 (methylenomycin，Mmy)超量產(chǎn)生，且產(chǎn)孢量也是野生型的2倍;S.avermitilis NRRL 8165中，nsdA基因的阻斷導(dǎo)致阿維菌素的產(chǎn)量提高了3～5倍;井岡霉素 (validamycin)產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)5008、鹽霉素(salinomycin)產(chǎn)生菌白色鏈霉菌 (Streptomyces albus)和慶豐霉素 (qingfengmycin)產(chǎn)生菌慶豐鏈霉菌 (Streptomyces qingfengmyceticus)等多種鏈霉菌中也發(fā)現(xiàn)有nsdA同源基因;陳芬等［14］阻斷肉桂地鏈霉菌 (Streptomyces cinnamoncnsis)中的nsdA基因后，莫能菌素 (monensin)的產(chǎn)量提高了2.7倍。郭鎖蓮等［15］等通過基因阻斷冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchenggensis)226541中的nsdA基因，發(fā)現(xiàn)米爾貝霉素 (milbemycins)和南昌霉素(nanchangmycin)的產(chǎn)量分別提高了1.5和9倍。nsdA的廣泛存在為抗生素生產(chǎn)菌高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供了新的靶標(biāo)。
研究發(fā)現(xiàn)，同樣來(lái)自于 S.coelicolor的 nsdB(SCO7252)也編碼TPR結(jié)構(gòu)的蛋白，阻斷nsdB基因使菌株的Act和CDA產(chǎn)量均提高，但形態(tài)分化沒有明顯變化［16］。含有 TPR結(jié)構(gòu)域蛋白的具體作用機(jī)制還不清楚，該蛋白是如何表達(dá)、如何影響別的基因以致最終影響到形態(tài)分化和次級(jí)代謝的，這些問題都尚未闡明，或許是一種影響鏈霉菌分化的新模式。
1.4 relA
在某些重要的營(yíng)養(yǎng)成分缺乏 (如氨基酸)時(shí)，細(xì)菌對(duì)某些基因和酶的表達(dá)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)控制，稱為嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng) (stringent response)。嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是細(xì)菌適應(yīng)不利環(huán)境的一種調(diào)控方式。許多研究發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)依賴于焦磷酸鳥苷酸 (p)ppGpp的瞬時(shí)增加，當(dāng)空載的tRNA結(jié)合到核糖體的A位點(diǎn)時(shí)，四磷酸鳥苷酸合成酶基因relA編碼的蛋白催化 (p)ppGpp合成，(p)ppGpp的合成增加激活抗生素的合成。在大腸桿菌 (Escherichia coli)中人們發(fā)現(xiàn)(p)ppGpp能夠改變RNA聚合酶對(duì)σ因子的選擇性，這說(shuō)明了 (p)ppGpp調(diào)控的靶點(diǎn)是 RNA聚合酶。當(dāng)RNA聚合酶β亞基利福平 (rifampicin)結(jié)合域上某個(gè)位點(diǎn)突變后， (p)ppGpp對(duì)抗生素合成的直接調(diào)控作用消失了，提示這個(gè)位點(diǎn)可能靠近或者就是 (p)ppGpp結(jié)合RNA聚合酶的位點(diǎn)［17］，(p)ppGpp結(jié)合RNA聚合酶后，使后者的構(gòu)象改變利于抗生素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄［18］。在鏈霉菌中，relA的敲除表現(xiàn)為氮源缺陷條件下抗生素合成的缺陷，研究也證實(shí)了 S.coelicolor中relA敲除突變株中抗生素合成基因轉(zhuǎn)錄水平下降，以及抗生素合成途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4和redD的轉(zhuǎn)錄明顯下調(diào)［19］。Gomez-Escribano 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，阻斷棒狀鏈霉菌 (Streptomyces clavuligerus)relA基因，使其不能形成氣生菌絲且不能產(chǎn)生孢子，克拉維酸 (clavulanic acid)和頭霉素 C(cephamycinC)的產(chǎn)量顯著增加。最近，Makitrynskyy等［21］將 S.coelicolor中 relA 基因?qū)爰蛹{鏈霉菌 (Streptomyces ghanaensis)ATCC 14672中異源過量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)默諾霉素產(chǎn)量增加了2倍。
1.5 rrdA
rrdA(regulator of redD)基因編碼TetR家族蛋白，在 S.coelicolor中被發(fā)現(xiàn)，隨后依次在 S.avermitilis、產(chǎn)二素鏈霉菌 (Streptomyces ambofaciens)ATCC 23877等鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)有同源基因。S.coelicolor rrdA阻斷突變株顯示 Red產(chǎn)量增加而 Act產(chǎn)量降低，將 rrdA多拷貝質(zhì)粒導(dǎo)入 S.coelicolor中過量表達(dá)導(dǎo)致Red產(chǎn)量大大降低而Act高產(chǎn);反轉(zhuǎn)錄PCR顯示RrdA通過阻遏redD mRNA的合成負(fù)調(diào)控Red的生物合成，但Act途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有發(fā)生變化，說(shuō)明RrdA對(duì)Act在轉(zhuǎn)錄水平上沒有起正調(diào)控作用，可能通過與Act和Red合成途徑的共同前體競(jìng)爭(zhēng)調(diào)控 Act的生物合成［22］。
1.6 sig6
鏈霉菌中的ECFσ因子能快速、準(zhǔn)確地調(diào)控不同的壓力應(yīng)答調(diào)控子以適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境。目前，僅有一部分ECFσ因子因其在形態(tài)分化和次級(jí)代謝的調(diào)控作用而被廣泛關(guān)注［23-25］。sig6(SAV663)存在于 S.avermitilis中，編碼 RNA聚合酶 ECFσ因子，敲除該基因后，阿維菌素的產(chǎn)量增加了2.0～2.7倍，但對(duì)S.avermitilis的生長(zhǎng)和形態(tài)無(wú)明顯影響;將含多拷貝sig6基因的質(zhì)粒導(dǎo)入S.avermitilis野生菌株后，阿維菌素的產(chǎn)量降低。說(shuō)明Sig6對(duì)S.avermitilis的阿維菌素起負(fù)調(diào)控作用［26］。RT-PCR分析證明，Sig6通過途徑特異性調(diào)控基因aveR調(diào)控阿維菌素的生物合成，這為通過改變ECFσ因子的活力增加鏈霉菌抗生素的產(chǎn)量開辟途徑。
1.7 ssgA
ssgA(sporulation-specific cell division)基因在S.coelicolor中過量表達(dá)導(dǎo)致 Red產(chǎn)量增加2～5倍，但Act的生物合成完全受阻［27］。S.coelicolor中Red生成的時(shí)間比 Act早，ssgA將 S.coelicolor的生理狀態(tài)控制在Red生成期，阻止其進(jìn)入Act生成期。因此，ssgA可能代表另外一種協(xié)調(diào)抗生素生物合成與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的新的重要模式［28］。由于ssgA對(duì)一些抗生素生物合成的正調(diào)控作用，現(xiàn)被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)菌株上，如van Wezel等［29］通過過量表達(dá)S.lividans中 ssgA基因，導(dǎo)致其次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量增加2.5倍，S.coelicolor中 ssgA過量表達(dá)導(dǎo)致Red產(chǎn)量增加近10倍。因此，ssgA的過量表達(dá)為抗生素高產(chǎn)菌株的構(gòu)建提供一種有效途徑。
1.8 wblA
wblA(WhiB-like transcription factor)基因首先于S.coelicolor中被發(fā)現(xiàn)，編碼 WhiB家族蛋白的同源物。其過量表達(dá)抑制 Act、Red和 CDA的合成，且不能產(chǎn)生孢子［30-31］。Noh 等［32］利用種間DNA微矩陣分析 (Interspecies DNA Microarray Analysis)發(fā)現(xiàn)波賽鏈霉菌 (Streptomyces peucetius)中也存在 wblA基因 (wblAspe)。阻斷 wblAspe導(dǎo)致阿霉素 (doxorubicin)道諾霉素 (doxorubucin)產(chǎn)量增加7倍。Rabyk等［33］在已測(cè)序的 S.ghanaensis中鑒定了 wblAgh基因，阻斷該基因發(fā)現(xiàn) S.ghanaensis氣生菌絲不能產(chǎn)生孢子，且默諾霉素的產(chǎn)量增加了2.3倍，說(shuō)明S.ghanaensis中的wblAgh基因和wblAsco、wblAspe一樣，負(fù)調(diào)控抗生素的生物合成，且與形態(tài)分化有關(guān)。
2 雙組分調(diào)控基因
在鏈霉菌中，雙組分調(diào)控系統(tǒng)是一類非常重要的全局調(diào)控系統(tǒng)，參與胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)、新陳代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)及形態(tài)分化等多種生理代謝過程，尤其與鏈霉菌復(fù)雜的形態(tài)分化和抗生素合成的調(diào)控有著密切的關(guān)系。本文就以下4種雙組分調(diào)控系統(tǒng)基因作詳細(xì)介紹 (表2)。
表2 鏈霉菌中雙組分調(diào)控系統(tǒng)基因及其功能
2.1 absA1-absA2
AbsA1-AbsA2(SCO3225-SCO3226)是S.coelicolor中研究得最為清楚的一對(duì)雙組分調(diào)控系統(tǒng)。absA1-absA2基因位于鈣依賴性抗生素(CDA)生物合成基因簇內(nèi)部，敲除S.coelicolor中absA1和absA2基因，證明了AbsA雙組分系統(tǒng)負(fù)調(diào)控Act、Red和CDA的合成［34］。轉(zhuǎn)錄分析顯示，AbsA1-AbsA2主要是通過影響途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4和redD的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控Act和Red的合成。而對(duì)于CDA生物合成的調(diào)控，是通過調(diào)控與CDA生物合成相關(guān)的多肽合成酶的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。AbsA1感應(yīng)外界環(huán)境變化并轉(zhuǎn)為激酶形式，對(duì)自身保守的組氨酸殘基磷酸化進(jìn)行自體激活，然后將自身的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到應(yīng)答調(diào)節(jié)子AbsA2保守的天冬氨酸殘基上，磷酸化的應(yīng)答調(diào)節(jié)子AbsA2再有力地結(jié)合到DNA的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控轉(zhuǎn)錄。當(dāng)外界信號(hào)消失或被降解，AbsA抑制被解除，AbsA1轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿崦感问?，將AbsA2去磷酸化，抗生素合成基因表達(dá)［35］。將absA1的等位基因?qū)隨treptomyces flavopersicus異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抗菌類物質(zhì)粉霉素(pulvomycin)的沉默基因被激活［36］。因此，AbsA雙組分調(diào)控系統(tǒng)的多效調(diào)控被廣泛應(yīng)用于開發(fā)新的抗菌物質(zhì)。
2.2 afsR-afsK
AfsR屬于STAND家族蛋白，由afsR基因編碼，N端有OmpR家族的兩個(gè)特征結(jié)構(gòu)域 (DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)，同時(shí)還含有結(jié)合ATP的保守motif，在其C端有TPR結(jié)構(gòu)域。通過磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，AfsR可以同時(shí)對(duì)多種抗生素的合成進(jìn)行調(diào)控。AfsK與細(xì)胞膜連接，感應(yīng)外界特定的環(huán)境信號(hào)，將自身蘇氨酸和絲氨酸殘基磷酸化，以增加其激酶活力［37］。細(xì)胞膜上被激活的AfsK催化磷酸化細(xì)胞質(zhì)中AfsR的蘇氨酸殘基和絲氨酸殘基，極大地增強(qiáng)了AfsR與DNA的結(jié)合能力［38］。AfsR-P結(jié)合到位于 afsR下游 afsS的啟動(dòng)子-35區(qū)域并激活它的轉(zhuǎn)錄，afsS編碼由63個(gè)氨基酸組成的蛋白AfsS，以未知方式正調(diào)控途徑特異性基因actⅡ-orf4、redD和cdaR，從而增加 Act、Red和CDA的產(chǎn)量［39-40］。afsR基因失活突變導(dǎo)致 S.coelicolor中 Act、CDA的產(chǎn)量明顯下降，導(dǎo)入 S.lividans中能促進(jìn)原本沉默的Act和Red的合成［41］。AfsK磷酸化AfsR的能力由afsK上游基因的編碼產(chǎn)物KbpA調(diào)節(jié)，當(dāng)KbpA與AfsK結(jié)合時(shí)，AfsK的激酶活力被抑制并阻止AfsR的磷酸化［42］。
在S.peucetius中也發(fā)現(xiàn)了AfsR的結(jié)構(gòu)類似物AfsR-p，當(dāng)其克隆到外源質(zhì)粒上ermE啟動(dòng)子下游并導(dǎo)入S. peucetius、 S. lividans TK24、 S.clavuligerus、S.griseus表達(dá)時(shí)，相應(yīng)的道諾霉素、Act、克拉維酸、鏈霉素分別提高了4倍、2.6倍、1.5 倍和略有提高［43］。
afsS啟動(dòng)子區(qū)是AfsR的結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)同時(shí)又是一個(gè)潛在的 PHO box。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)和DNA足跡實(shí)驗(yàn) (DNA footprinting assay)的結(jié)果驗(yàn)證了PhoP和AfsR在afsS基因啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別序列是重合的;體外結(jié)合試驗(yàn)證明了PhoP和AfsR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合afsS啟動(dòng)子區(qū)，AfsR同時(shí)能夠結(jié)合PhoP調(diào)控的基因，如pstS和phoR/phoP的啟動(dòng)子區(qū);報(bào)告基因 luxAB實(shí)驗(yàn)證實(shí) PhoP可下調(diào) afsS的表達(dá)，AfsR可下調(diào) pstS和 phoR/phoP的表達(dá)［44］。這表明PhoP和AfsR這兩個(gè)全局調(diào)控因子之間存在復(fù)雜的相互交叉作用。
2.3 cutS-cutR
CutS-CutR(SCO5863-SCO5862)是鏈霉菌中第1個(gè)被鑒定的雙組分調(diào)控系統(tǒng)［45］。迄今為止，多種鏈霉菌中均有報(bào)道該雙組分調(diào)控系統(tǒng)的存在。插入突變實(shí)驗(yàn)顯示，CutR-CutS的基因阻斷會(huì)引起S.lividans抗生素Act的過量生成;而當(dāng)CutR-CutS在S.coelicolor中過量表達(dá)時(shí)，Act的生物合成明顯被抑制，因此與AbsA1-AbsA2一樣，CutR-CutS對(duì)抗生素Act的生物合成也起負(fù)調(diào)控作用［46］。
2.4 phoR-phoP
磷酸鹽是活細(xì)胞的重要組成成分，其重要作用及其在自然界中的缺乏使得細(xì)菌進(jìn)化出多種應(yīng)對(duì)磷酸鹽缺乏的機(jī)制，這些機(jī)制導(dǎo)致細(xì)菌能夠適應(yīng)貧磷酸鹽的環(huán)境。能夠響應(yīng)磷酸鹽濃度變化的蛋白共同組成一個(gè)家族，稱為 Pho調(diào)控子 (phosphate regulon)，PhoR-PhoP及其所調(diào)控基因編碼的產(chǎn)物均屬于PHO調(diào)控子家族［47］。該調(diào)控子家族成員的序列具有共同特征，即在其啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)PHO box序列。低磷酸鹽濃度一直被認(rèn)為能夠刺激抗生素和其他次級(jí)代謝物的產(chǎn)生，包括了鏈霉素、四環(huán)素等［48］。在 E.coli中低磷酸鹽濃度傳遞的信號(hào)首先使得感應(yīng)器激酶 (PhoR)自我磷酸化，然后PhoR又將這個(gè)磷酸基團(tuán)傳遞到相應(yīng)調(diào)控蛋白(PhoP)的一個(gè)N端天冬氨酸殘基上，導(dǎo)致PhoP與其調(diào)控基因啟動(dòng)子的結(jié)合能力大大提高，增強(qiáng)了這些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，PhoP的結(jié)合位點(diǎn)一般就是PHO box序列。在S.lividans中敲除 PhoR-PhoP雙組分系統(tǒng)基因的突變株表現(xiàn)出堿性磷酸酶 (AP)活性的降低和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的減少，同時(shí)Act和Red的大量產(chǎn)生，且無(wú)論在高磷酸鹽還是低磷酸鹽情況下產(chǎn)生Act和Red的能力均高于野生型菌株，說(shuō)明PhoR-PhoP雙組分系統(tǒng)抑制了抗生素的產(chǎn)生［49］。
2.5 rapA1-rapA2
2007年，Lu等［50］在 S.coelicolor中發(fā)現(xiàn)了一新的TCS，命名為RapA1-RapA2(regulation of both actinorhodin and a typeⅠ polyketide)，調(diào)控 Act和Ⅰ型聚酮化合物的生物合成。敲除rapA1-rapA2基因后，其生長(zhǎng)和形態(tài)與野生菌株M145相比沒有差異，但是Act和Ⅰ型聚酮化合物的產(chǎn)量明顯降低。其作用模式與absA1-absA2類似，通過影響途徑特異性調(diào)控基因actⅡ-orf4和kasO的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控Act和Ⅰ型聚酮化合物的合成，但其對(duì)Act和Ⅰ型聚酮化合物的調(diào)控可能代表 S.coelicolor中一種新的調(diào)控途徑。
2.6 abrA1-abrA2
2011年，Yepes等［51］在 S.coelicolor M145 中發(fā)現(xiàn)一種新的雙組分調(diào)控基因 abrA1-abrA2(antibiotic rugulator)，敲除該基因后，Act、Red和CDA的產(chǎn)量高于野生型菌株，且不產(chǎn)孢子，說(shuō)明abrA1-abrA2負(fù)調(diào)控抗生素的生物合成和形態(tài)分化。
3 小結(jié)與展望
鏈霉菌抗生素生物合成全局調(diào)控的顯著特點(diǎn)之一就是它的多樣性和復(fù)雜性。不同的基因應(yīng)答不同的環(huán)境、生理信號(hào)和一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)介導(dǎo)的外界壓力。全局調(diào)控基因多效調(diào)控多種抗生素的生物合成，大部分是以層層級(jí)聯(lián)的方式間接調(diào)控，只有AbsA1-AbsA2和rapA1-rapA2等少數(shù)效應(yīng)因子直接作用于抗生素合成途徑中的途徑特異性調(diào)控基因。不同調(diào)控基因之間也存在著交叉作用，導(dǎo)致抗生素生物合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)更為復(fù)雜。要將復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究透徹是一個(gè)巨大的工程。目前，全基因組測(cè)序、全基因組微距陣、蛋白質(zhì)組學(xué)和基因表達(dá)的時(shí)間-空間分析的發(fā)展，為理清調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜關(guān)系提供了有效的手段。
加強(qiáng)對(duì)農(nóng)用抗生素生物合成全局調(diào)控的研究，將加速構(gòu)建新農(nóng)藥產(chǎn)生菌或抗生素高產(chǎn)菌株的研究過程。默諾霉素作為動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑而廣泛應(yīng)用于飼料添加劑，作者以relA和nsdA基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用基因工程手段阻斷這兩個(gè)基因的編碼，研究其對(duì)斑伯鏈霉菌 (Streptomyces bambergiensis)和加納鏈霉菌 (Streptomyces ghanaensis)中默諾霉素的產(chǎn)量及形態(tài)分化的影響，為進(jìn)一步闡明次級(jí)代謝和形態(tài)分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定一定基礎(chǔ)。
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