周向陽，萬 婧，廖 迅，朱竹君，陳曉瑋，劉菲芬，方維煥

（1.舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江舟山 316000；2.浙江大學(xué)浙江省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一，具有高傳染性和高致病性的特點(diǎn)，給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動物傳染病。豬瘟的病原為豬瘟病毒（CSFV），屬黃病毒科瘟病毒屬成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒［1］?；蚪M長約12.3kb，可分為3部分，兩端分別為5′和3′端非編碼區(qū)（untranslated region，UTR），中部為編碼區(qū)，可編碼一個(gè)由3 898個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白。此多聚蛋白可被加工形成12種病毒特異性蛋白，其中4種為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，8種為非結(jié)構(gòu)蛋白［2］。

結(jié)構(gòu)蛋白E2在CSFV感染過程中起著重要作用，是主要保護(hù)性抗原，基于E2的疫苗（如DNA疫苗和病毒載體疫苗）免疫后，不僅可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，還能產(chǎn)生特異性的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)機(jī)體免受強(qiáng)毒的攻擊［3－5］。因此，E2蛋白是豬瘟免疫和免疫效果監(jiān)測的理想抗原，無論是在病毒檢測還是在疫苗研制上都具有重要作用。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是目前比較有效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一，此系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)可以進(jìn)行正確的折疊、二硫鍵的搭配和翻譯后的加工，包括糖基化、磷酸化、?；⑿盘栯那谐半亩蔚那懈詈头纸獾?，修飾的位點(diǎn)與天然蛋白在細(xì)胞內(nèi)的情況完全一致。桿狀病毒表達(dá)載體經(jīng)常用來表達(dá)具有特定結(jié)構(gòu)功能的糖蛋白，而且在昆蟲細(xì)胞發(fā)生的糖基化位點(diǎn)與哺乳動物細(xì)胞中相同。本研究旨在利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CSFV石門株的E2囊膜糖蛋白，并對其活性進(jìn)行初步鑒定，為研究E2蛋白的功能，免疫原性，篩選抗原表位以及開發(fā)新型疫苗等方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞和毒株 Sf9昆蟲細(xì)胞、基因1型豬瘟病毒石門株由浙江大學(xué)浙江省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。DH10Bac菌株、轉(zhuǎn)移載體pFast－BacHTA和轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin購自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)基TC－100和胎牛血清購自Gibco公司。Sf9昆蟲細(xì)胞用添加100mL／L胎牛血清的培養(yǎng)基于27℃恒溫培養(yǎng)。豬睪丸細(xì)胞系ST由浙江大學(xué)浙江省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供，用含100mL／L胎牛血清的MEM培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 UNIQ－10柱式總RNA提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；RNA酶抑制劑購自北京鼎國生物技術(shù)中心；ExTaq酶、2.5mmol／L dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶以及pMD－18T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen生物技術(shù)公司；FITC標(biāo)記羊抗兔IgG購自美國KPL公司；抗豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體2B10由浙江大學(xué)浙江省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并提供制備；鼠抗6×His－單克隆抗體、HRP羊抗鼠IgG多克隆抗體為美國GenScript公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆 用CSFV石門株感染ST細(xì)胞72h后，按照UNIQ－10柱式總RNA提取試劑盒的說明提取總RNA。在1.5mL離心管中分別加入上述總 RNA 9.5μL，4μL 5×RT－緩沖液，0.5μL RNase抑制劑，2μL dNTP，1μL Radom Prime，0.5μL M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，2.5μL DEPC水，42℃孵育1h，90℃作用5min，滅活 M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶，獲得反轉(zhuǎn)錄的cDNA。根據(jù)CSFV石門株的基因組E2基因序列及供體質(zhì)粒pFastBacHTA中多克隆位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，分別在基因的5′端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，3′端引入HindⅢ酶切位點(diǎn)。E2－F 5′－AGGATCCGCGGCTAGCCTGCAAGGAAGAT－3′，E2－R 5′－GCAAGCTTTTAACCAG CGGCGAGTTGTTC－3′引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR克隆上述基因片段。反應(yīng)體系：cDNA 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，5U／μL ExTaq酶 0.5 μL，10×PCR buffer 5.0μL，2.5mmol／L dNTP（含 MgCl2）4.0μL，最 后 加H2O至總體積50μL。反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃50s，55℃30s，72 ℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃7min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測割膠回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物克隆到pMD－18T載體，經(jīng) PCR鑒定陽性克隆pMD－18TE2質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.2 重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建 對pMD－18T－E2用BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，克隆入預(yù)先進(jìn)行了雙酶切的供體質(zhì)粒pFastBacHTA中，經(jīng)酶切鑒定后，得到一個(gè)重組供體質(zhì)粒，命名為pFastBacHTAE2。

1.2.3 重組Bacmid的篩選及鑒定 用獲得的重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA－E2轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)4h后，通過含100g／mL X－gal、40g／mL IPTG、7g／mL 慶大霉素、50g／mL卡那霉素和10g／mL四環(huán)素的LB平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，次日挑取白斑培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基（含有7g／mL慶大霉素、50g／mL卡那霉素和10g／mL四環(huán)素），37℃震蕩培養(yǎng)過夜，用堿裂解法小量提取重組Bacmid，用M13通用引物對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.4 重組病毒的獲得 參照Lipofectin產(chǎn)品說明書將鑒定為重組的Bacmid轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的Sf9細(xì)胞，27℃培養(yǎng)120h后，收獲重組病毒，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，5 000r／min離心5min，將含有重組病毒的上清4℃臨時(shí)保存或在－80℃長期儲存?zhèn)溆?。將?代重組病毒在Sf9細(xì)胞上傳3代，得到高滴度的重組病毒。

1.2.5 Western blot分析 將病毒感染的Sf9細(xì)胞用50μL蒸餾水懸浮，然后與5×SDS樣品緩沖液等體積混合，100℃水浴煮5min～8min，冰上放置2min。在4℃以14 000r／min離心5min，進(jìn)行120g／L SDSPAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，進(jìn)行Western blot分析。分別使用抗E2蛋白的單抗2B10和6×His－單克隆抗體作為一抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，最后ECL化學(xué)發(fā)光顯色。

1.2.6 間接免疫熒光 用重組病毒感染Sf9細(xì)胞96 h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，用預(yù)冷的800 mL／L丙酮－20℃固定15min。棄去固定液，PBS洗滌3次，自然干燥后加入抗E2蛋白的單抗2B10，置37℃培養(yǎng)箱作用2h；PBS洗滌5次，再加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃作用1h；最后PBS洗滌5次，500mL／L磷酸甘油封底，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 CSFV石門株E2囊膜糖蛋白基因的克隆

以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增出約1.1kb的片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。將目的條帶割膠回收克隆到pMD－18T載體，測序結(jié)果表明成功亞克隆了CSFV石門株E2囊膜糖蛋白的基因。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.E2基因M.DNA Marker DL 5 000；1.E2gene

圖1 E2基因的PCR擴(kuò)增Fig.1PCR amplification of the E2gene

2.2 重組質(zhì)粒和重組Bacmid的獲得

將目的基因亞克隆到供體質(zhì)粒pFastBacHTA中，經(jīng)BamHI和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，獲得重組供體質(zhì)粒pFastBacHTA－E2（圖2）。從白色菌斑中抽提Bacmid DNA，以 M13－F、R引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得3.5kb左右的片段，而用藍(lán)斑提取的DNA作為模板，PCR產(chǎn)物為300bp，證實(shí)含目的基因的Bacmid構(gòu)建成功（圖3）。

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2Identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion

圖3 重組Bacmid的PCR鑒定Fig.3PCR analysis of recombinant Bacmid

2.3 重組病毒的獲得

重組的Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞120h后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生明顯的病變，與正常細(xì)胞相比，感染細(xì)胞的直徑變大、形狀變圓，細(xì)胞核增大，繼而離壁漂浮、脫落。連續(xù)傳3代后病變明顯增強(qiáng)，病變出現(xiàn)時(shí)間縮短，即獲得高滴度的重組病毒。

2.4 表達(dá)蛋白的Western blot分析

用重組病毒感染Sf9細(xì)胞96h后，收集感染的細(xì)胞，進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測和Western blot分析。分別使用抗E2蛋白的單抗和6×His－單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的鼠抗兔IgG抗體作為二抗，在43ku處可以看到清晰的特異性條帶，與預(yù)測的蛋白的分子質(zhì)量大小一致，表明E2蛋白在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)（圖4）。

圖4 E2囊膜糖蛋白在Sf9細(xì)胞中表達(dá)的Western blot分析Fig.4Western blot analysis of E2protein in Sf9cells

2.5 E2表達(dá)蛋白的間接免疫熒光分析

用重組病毒感染Sf9細(xì)胞96h后，分別用抗E2蛋白的單抗2B10和6×His－單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體為二抗，于熒光顯微鏡下觀察到Sf9細(xì)胞發(fā)出綠色熒光（圖5）。

3 討論

桿狀病毒載體結(jié)合昆蟲細(xì)胞系可以生產(chǎn)高水平的重組蛋白，與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，產(chǎn)生的重組蛋白經(jīng)過了翻譯后加工修飾，而且其宿主范圍窄（僅限于昆蟲），因而對脊椎動物而言具有較好的生物安全性［6］。另外，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用的昆蟲細(xì)胞系來源于鱗翅目昆蟲，培養(yǎng)相對容易不需要二氧化碳培養(yǎng)箱，可以在無血清培養(yǎng)基中生長而且可以很容易地?cái)U(kuò)大規(guī)模［7］。此外，該系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物帶有6個(gè)His組氨酸標(biāo)簽，有利于重組蛋白的純化。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)的外源蛋白能夠用于蛋白功能研究、疫苗制備或診斷。

由于囊膜糖蛋白E2在CSFV感染過程中的重要作用，使其成為了近年來研究的熱點(diǎn)。部分或者完全缺失E2基因的病毒沒有感染性［8］。由于E2蛋白是CSFV的主要保護(hù)性抗原蛋白，具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，保護(hù)動物免受強(qiáng)毒的攻擊［9］，因此，在病毒檢測和疫苗研制方面具有重要應(yīng)用。目前在疫苗生產(chǎn)中主要使用原代牛睪丸細(xì)胞進(jìn)行病毒增殖，但有時(shí)會出現(xiàn)病毒毒價(jià)不穩(wěn)定，甚至檢測不到子代病毒等問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者將豬瘟疫苗的研究集中到亞單位疫苗、核酸疫苗和病毒載體疫苗上。通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的第一個(gè)被批準(zhǔn)的商品化疫苗就是豬瘟疫苗［10－11］。本研究表達(dá)了CSFV石門強(qiáng)毒株的E2蛋白，可以比較強(qiáng)弱毒株間E2蛋白的免疫原性，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。而且E2囊膜糖蛋白內(nèi)部有1個(gè)在CSFV各毒株間高度保守的抗原表位，即829到837位的TAVSPTTLR（結(jié)合單抗為WH303），而此表位在BVDV和BDV毒株間卻非常易變，因此具有一定的診斷價(jià)值［12］。目前的研究已經(jīng)證明，E2蛋白與CSFV的毒力有關(guān)，通過DNA分子重組和反向遺傳學(xué)技術(shù)，置換強(qiáng)弱毒株的E2，結(jié)果表明病毒的毒力明顯減弱［13］，利用真核系統(tǒng)表達(dá)具有天然狀態(tài)的E2蛋白，對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能分析可能會有助于解答E2蛋白如何影響強(qiáng)弱毒株的毒力。CSFV感染細(xì)胞的第1個(gè)關(guān)鍵步驟是病毒與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，在病毒受體的介導(dǎo)下使病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和繁殖。E2蛋白在病毒吸附進(jìn)入靶細(xì)胞方面也發(fā)揮了重要作用，所以在E2的基礎(chǔ)上篩選出CSFV的配體結(jié)合表位以及與細(xì)胞結(jié)合的受體，對研制CSFV的新型多肽藥物和多肽疫苗具有重要意義［14］。

本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建含有CSFV石門株結(jié)構(gòu)蛋白E2蛋白編碼基因的重組病毒，將重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了E2囊膜糖蛋白在Sf9昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)，為深入研究CSFV病毒結(jié)構(gòu)蛋白E2的功能以及研制病毒的新型疫苗奠定了基礎(chǔ)。在Sf9培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的E2囊膜糖蛋白的純化和免疫保護(hù)作用的研究有待進(jìn)一步開展。

圖5 間接免疫熒光分析E2蛋白的表達(dá)Fig.5Analysis of the E2protein by IFA

［1］Liu L，Xia H，Wahlberg N，et al.Phylogeny，classification and evolutionary insights into pestiviruses［J］.Virology，2009，385（2）：351－357.

［2］Chen N，Tong C，Li D，et al.Antigenic analysis of classical swine fever virus E2glycoprotein using pig antibodies identifies residues contributing to antigenic variation of the vaccine C－strain and group 2strains circulating in China［J］.Virol J，2010，7（1）：378.

［3］Ganges L，Barrera M，Nunez J I，et al.A DNA vaccine expressing the E2protein of classical swine fever virus elicits T cell responses that can prime for rapid antibody production and confer total protection upon viral challenge［J］.Vaccine，2005，23（28）：3741－3752.

［4］Sun Y，Li N，Li H Y，et al.Enhanced immunity against classical swine fever in pigs induced by prime－boost immunization using an alphavirus replicon－vectored DNA vaccine and a recombinant adenovirus［J］.Vet Immunol Immunopathol，2010，137（1－2）：20－27.

［5］Sanchez O，Barrera M，Rodriguez M P，et al.Classical swine fever virus E2glycoprotein antigen produced in adenovirally transduced PK－15cells confers complete protection in pigs upon viral challenge［J］.Vaccine，2008，26（7）：988－997.

［6］van Oers M M.Opportunities and challenges for the baculovirus expression system［J］.J Invertebr Pathol，2011，107Suppl：S3－15.

［7］Smagghe G，Goodman C L，Stanley D，et al.Insect cell cul－ture and applications to research and pest management［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，2009，45（3－4）：93－105.

［8］Moormann R J，van Gennip H G，Miedema G K，et al.Infectious RNA transcribed from an engineered full－length cDNA template of the genome of a pestivirus［J］.J Virol，1996，70（2）：763－770.

［9］Bouma A，de Smit A J，de Kluijver E P，et al.Efficacy and stability of a subunit vaccine based on glycoprotein E2of classical swine fever virus［J］.Vet Microbiol，1999，66（2）：101－114.

［10］van Rijn P A，van Gennip H G P，Moormann R J M，et al.An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2of classical swine fever virus（CSFV）［J］.Vaccine，1999，17（5）：433－440.

［11］van Gennip H G，van Rijn P A，Widjojoatmodjo M N，et al.Chimeric classical swine fever viruses containing envelope protein E（RNS）or E2of bovine viral diarrhoea virus protect pigs against challenge with CSFV and induce a distinguishable antibody response［J］.Vaccine，2000，19（4－5）：447－459.

［12］Chang C Y，Huang C C，Lin Y J，et al.Identification of antigen－specific residues on E2glycoprotein of classical swine fever virus［J］.Virus Res，2010，152（1－2）：65－72.

［13］Lin M，Lin F，Mallory M，et al.Deletions of structural glycoprotein E2of classical swine fever virus strain alfort／187 resolve a linear epitope of monoclonal antibody WH303and the minimal N－terminal domain essential for binding immunoglobulin G antibodies of a pig hyperimmune serum［J］.J Virol，2000，74（24）：11619－11625.

［14］Risatti G R，Holinka L G，F(xiàn)ernandez Sainz I，et al.Mutations in the carboxyl terminal region of E2glycoprotein of classical swine fever virus are responsible for viral attenuation in swine［J］.Virology，2007，364（2）：371－382.

［15］Tarradas J，MonsóM，Munoz M，et al.Partial protection against classical swine fever virus elicited by dendrimeric vaccine－candidate peptides in domestic pigs［J］.Vaccine，2011，29（26）：4422－4429.