孫 浩，王奇志，王 鳴，馮 煦

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇南京210014)

四妙勇安湯是治療血栓閉塞性脈管炎的傳統(tǒng)效方，始載于清代的鮑相敖《驗(yàn)方新編》中，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草組成，各地多以此方為主，隨證加減，治療各型、各期患者，均取得滿意的療效，并由此方演化派生出許多針對(duì)血栓閉塞性脈管炎病變過(guò)程中各期、各型的有效方劑，在提高臨床療效方面，取得了顯著的成果被眾多醫(yī)家所推崇。本組方是在古方四妙勇安湯的基礎(chǔ)上加石斛、牛膝而組成，方中金銀花、玄參涼血清熱;當(dāng)歸活血化瘀;石斛滋陰養(yǎng)血;牛膝活血通絡(luò)，引諸藥通達(dá)患肢;甘草調(diào)和諸藥、排毒，優(yōu)化后四妙勇安湯在治療心腦血管方面療效更加明確。組方經(jīng)水提醇沉，乙酸乙酯萃取，酯浸膏水能溶部分為其治療心腦血管的有效部位，本文對(duì)該有效部位中總黃酮進(jìn)行定量分析，采用紫外可見(jiàn)分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品，以硝酸鋁為顯色劑，檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm波長(zhǎng)，為四妙勇安湯加石斛、牛膝復(fù)方治療心腦血管有效部位總黃酮的含量測(cè)定提供一種操作簡(jiǎn)單、科學(xué)準(zhǔn)確的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津UV－2501型);電子天平(Sartorius BP211D)。HH一6數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。容量瓶、移液管:天津市天波玻璃儀器有限公司。

1.1.2 試藥

蘆丁對(duì)照品(批號(hào):100080－200707，供含量測(cè)定用，純度為92.5%)，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;水為樂(lè)百氏純凈水;亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，無(wú)水乙醇，甲醇，冰醋酸(均為分析純，上海久億化學(xué)試劑有限公司)。四妙勇安湯治療血栓有效部位自制。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇超聲溶解制成濃度為0.15 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

取金銀花30 g、玄參30 g、石斛30 g、牛膝30 g、當(dāng)歸30 g、甘草15 g，每次加水600 mL，70℃熱提3次，合并提取液，減壓濃縮至小體積，加醇進(jìn)行醇沉，減壓濃縮醇溶液至無(wú)醇味，混懸與水，用乙酸乙酯萃取得酯浸膏，加水進(jìn)行水沉，水溶解部分為治療血栓的有效部位。定容至100 mL即得供試品溶液。

1.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別精密移取蘆丁對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 mL分別置于10 mL量瓶中，加30%乙醇約至5 mL，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后加1.0 mol/L NaOH液2 mL，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min后，在200～800 nm全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果確定檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm。

1.2.4 線性關(guān)系的考察

精密移取對(duì)照品溶液 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后，加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后加1.0 mol/L NaOH液2 mL，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min后，以零管為空白，用1 cm的比色杯，在510 nm處測(cè)定吸光度，繪制蘆丁含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸收度對(duì)濃度進(jìn)行回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Conc=K1A+K0，K1=88.34，K0= －0.868，Chi－ Square:0.00044。y=0.1697926x+0.009835，r=0.9997，線性工作范圍:0～0.0612 mg/mL。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份樣品，置10 mL量瓶中，平行5份，用30%乙醇稀釋至刻度，按“1.2.4”的方法在510 nm處測(cè)定其吸收度，結(jié)果平均含量(%)=36.37，RSD=1.91%(n=5)。

1.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，顯色后，以空白溶劑作為參比，在相同條件下510 nm處連續(xù)測(cè)定其吸光度5次。計(jì)算平均吸收度和RSD值，結(jié)果RSD為0.72%，表明精密度良好。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液，顯色后，以空白溶劑作為參比，在 510 nm 處，分別在 0、10、20、30、40、50、60 min測(cè)定其吸光度，計(jì)算60 min內(nèi)的RSD，結(jié)果RSD為0.82%，表明在60 min內(nèi)顯色基本穩(wěn)定。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取蘆丁對(duì)照品0.1997 g(純度為92.5%)，置于50 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為3.994 mg/mL的蘆丁對(duì)照品液。取已知含量的同一供試品，平行6份，置于10 mL量瓶中，精密加入蘆丁對(duì)照品液，用30%乙醇溶解稀釋至刻度，搖勻，按“1.2.4”的方法加入顯色劑，以試劑為空白對(duì)照，在510 nm處分別測(cè)定其吸光度。計(jì)算加樣回收率，結(jié)果平均回收率為99.60%，RSD:0.84%(n=6)。

1.2.9 樣品含量測(cè)定

按“1.2.2”的方法分別制備6批供試品溶液，置10 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min后加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后加1.0 mol/L NaOH液2 mL，用30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min后，以試劑為空白對(duì)照，于紫外分光光度計(jì)510 nm處測(cè)定吸收，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算總黃酮含量，有效部位中總黃酮的平均含量為37.76%。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 有效部位中總黃酮的含量測(cè)定

2 結(jié)論與討論

(1)為考察隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響，取同一供試品，通過(guò)3個(gè)不同操作者在同一臺(tái)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上，按筆者擬定的含量測(cè)定方法分析供試品中以蘆丁計(jì)的總黃酮含量，結(jié)果3個(gè)操作者測(cè)得的平均總黃酮含量為37.96%，RSD=2.03%。這表明該方法的精密度高，穩(wěn)定可靠。

(2)采用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定四妙勇安湯加石斛、牛膝治療血栓有效部位中有效部位總黃酮的含量，具有準(zhǔn)確度高、重復(fù)性強(qiáng)和線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。該方法操作簡(jiǎn)單，分析速度快，投入成本低，適合用于四妙勇安湯加石斛、牛膝治療血栓有效部位中總黃酮的含量測(cè)定和質(zhì)量控制。

［1］國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站.植物藥有效成分手冊(cè)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1986:902.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(—部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:246.

［3］陳卓，宋娟，周熙艷，等.四妙勇安湯抗炎有效部位中總黃酮的含量測(cè)定［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(6):385－387.