王庭輝，馬暉玲

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中－美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）屬豆科多年生植物，是世界上最重要的飼料作物，有“牧草之王”的美稱(chēng)，目前世界苜蓿栽培面積為3500萬(wàn)hm2，在我國(guó)已有2000年的栽培歷史［1］。自1958年Renert和Steward從胡蘿卜愈傷織和懸浮細(xì)胞體系中獲得體細(xì)胞胚以來(lái)，植物組織培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速發(fā)展。隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷完善，使得生物技術(shù)在育種上的應(yīng)用成為了可能，大大加快了我國(guó)牧草育種的進(jìn)展［2］。王發(fā)生等［3］對(duì)紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生做了詳細(xì)研究。但是，在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中超度含水態(tài)苗［4，5］，由于其難以移栽成活，嚴(yán)重影響植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。1981年Debergh等［6］提出了試管植物“玻璃化作用”的概念。陳兵先等［7］對(duì)植物組織培養(yǎng)中玻璃化現(xiàn)象做了詳細(xì)報(bào)道。

通過(guò)組培體系獲得轉(zhuǎn)基因植株，是目前生物技術(shù)手段改良植物品種的途徑之一，而組培過(guò)程中出現(xiàn)的污染，褐化和玻璃化是影響植物組培體系建立的3大難題［8］，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，組培體系顯得尤為重要。陶銘［9］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致再生苗玻璃化的原因主要有培養(yǎng)基、培養(yǎng)容器、環(huán)境條件及外植體種類(lèi)等，但其誘發(fā)機(jī)理至今尚無(wú)定論。李云霞等［10］以新疆大葉，甘農(nóng)三號(hào)和隴東苜蓿為試材，對(duì)紫花苜蓿組培體系中常見(jiàn)褐化原因進(jìn)行了分析并提出了解決辦法。吳麗芳等［11］對(duì)紫花苜蓿組織培養(yǎng)中常見(jiàn)問(wèn)題也提出了解決對(duì)策。同時(shí)，亓建飛等［12］對(duì)組培中畸形苗的發(fā)生機(jī)理做了闡述。擬通過(guò)摸清影響和田苜蓿組織培養(yǎng)過(guò)程中玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生的部分因素，提出應(yīng)對(duì)措施，為消除紫花苜蓿組織培養(yǎng)過(guò)程中的玻璃化現(xiàn)象提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

成熟的和田苜蓿種子采自新疆和田地區(qū)民豐縣苜蓿原種站。

1.2 方法

挑選飽滿(mǎn)顏色較好的新疆和田苜蓿種子，用自來(lái)水浸泡40min，用75%酒精處理30s，后用0.1%升汞浸泡10min，無(wú)菌水沖洗4～5次，將種子表面的升汞沖洗干凈，接于MS培養(yǎng)基中，室內(nèi)自然光光照培養(yǎng)，待種子萌發(fā)至2～3cm，取其下胚軸為外植體，切成0.5cm×0.5cm的小塊，轉(zhuǎn)接于 MS＋2.0mg/L 2，4－D＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂［11］誘導(dǎo)愈傷組織，時(shí)間為20～25d（圖1－1）。將愈傷組織轉(zhuǎn)接到前期分化培養(yǎng)基，誘導(dǎo)芽分化培養(yǎng)基為 MS＋6－BA 0.5mg/L＋NAA 0.05mg/L＋瓊脂0.9%［13］（圖1－2），直至分化出幼小再生苗。

30～35 d后選取健康無(wú)污染的幼小和田苜蓿再生苗接種在MS基本培養(yǎng)基上，設(shè)置不同濃度6－BA和NAA的組合、不同蔗糖含量、不同瓊脂濃度、不同光照強(qiáng)度作單因子處理，每個(gè)處理20株，每瓶5株，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件：25～28℃，光照周期16h。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

在不同因素作用下，培養(yǎng)30d后，觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)組培苗出現(xiàn)玻璃化的情況，用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素的差異顯著性分析，并按公式計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 6－BA和NAA濃度對(duì)和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在添加20g/L蔗糖，7g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基中，添加不同濃度6－BA和NAA，在光照強(qiáng)度為1 000～1 200lx的條件下，接種繼代培養(yǎng)后的和田苜蓿再生苗，接種30d后觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著6－BA和NAA濃度的升高，再生苗玻璃化率逐漸增大，當(dāng)6－BA為2.0mg/L、NAA 為0.5mg/L時(shí)其增殖系數(shù)達(dá)到最大，為1.93，玻璃化率為38%；當(dāng)6－BA為2.0mg/L、NAA 為1mg/L 時(shí)，其增殖系數(shù)為1.75，玻璃化率為60%（圖1－3），研究表明，隨著6－BA和NAA濃度的升高，和田苜蓿再生苗的玻璃化現(xiàn)象加重，而其再生苗增殖系數(shù)先升高后降低。綜合考慮，選擇2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA為和田苜蓿再生苗分化的最佳激素濃度配比。

2.2 蔗糖濃度對(duì)和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

將繼代培養(yǎng)的分化苗接種于添加2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA和7g/L的瓊脂的MS培養(yǎng)基中并附加不同濃度的蔗糖，在光照強(qiáng)度為1 000～1 200lx的條件下，培養(yǎng)30d后觀(guān)察統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2），隨著蔗糖濃度的增加，再生苗的玻璃化率逐漸降低，當(dāng)蔗糖濃度為30g/L時(shí)，其玻璃化率最低，為17%；增殖系數(shù)在增大的情況下又減小，當(dāng)蔗糖濃度為20g/L的時(shí)候，其增殖系數(shù)達(dá)到最大，為1.63。當(dāng)蔗糖濃度為20g/L和25g/L時(shí)，其增殖芽數(shù)最多，增殖系數(shù)差異不顯著，并且玻璃化率比較低（圖1－4），所以當(dāng)蔗糖濃度為20～25g/L時(shí)適合和田苜蓿再生苗的生長(zhǎng)。

表1 不同激素濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 1 Effect of different hormones combination on vitrification of hetian alfalfa

表2 不同蔗糖濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 2 Effect of sugar combination on vitrification of hetian alfalfa

2.3 瓊脂濃度對(duì)和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在添加2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA 和20 g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中加不同濃度的瓊脂，光照強(qiáng)度為1 000～1 200lx的條件下，接種繼代培養(yǎng)后的再生苗，30d后觀(guān)察。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著瓊脂濃度的增大，其玻璃化率逐漸減小，當(dāng)瓊脂濃度為5g/L時(shí)，再生苗玻璃化現(xiàn)象最嚴(yán)重（表3，圖1－5），玻璃化率達(dá)到78%。瓊脂濃度為7g/L和8g/L時(shí)，其增殖系數(shù)差異性顯著，玻璃化率差異性不顯著，因此，選擇7g/L的瓊脂濃度作為和田苜蓿最佳的再生苗分化濃度。

表3 不同瓊脂濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 3 Effect of agar combination on vitrification of hetian alfalfa

2.4 光照強(qiáng)度對(duì)和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在含2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA＋20g/L蔗糖＋7g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，接種繼代培養(yǎng)后的和田苜蓿再生苗，置于不同光照強(qiáng)度的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，30d后觀(guān)察。結(jié)果表明，隨著光照強(qiáng)度增加，再生苗芽增殖能力先升高再下降，在光照強(qiáng)度為1 000lx時(shí)，增殖芽數(shù)最多，為25.67，其增殖系數(shù)最大；當(dāng)光照強(qiáng)度為1 000lx和1 200lx時(shí)，其增殖系數(shù)差異性不顯著。當(dāng)光照強(qiáng)度為1 000lx和1 200lx時(shí)，和田苜蓿玻璃化苗情況不嚴(yán)重，玻璃化率明顯低于其他2個(gè)光照強(qiáng)度（表4，圖1－6）。因此，選擇1 000～1 200lx的光照強(qiáng)度為和田苜蓿再生苗分化培養(yǎng)的光照強(qiáng)度。

表4 不同光照強(qiáng)度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 4 Effect of Light intensity on vitrification of hetian alfalfa

圖1 和田苜蓿再生狀況Fig.1 Regeneration of hetian alfalfa

3 討論

玻璃化苗現(xiàn)象普遍存在于組織培養(yǎng)過(guò)程中，試管苗玻璃化嚴(yán)重影響了植物組織培養(yǎng)的效率和質(zhì)量，因此，試管苗玻璃化問(wèn)題的解決有助于整個(gè)植物組織培養(yǎng)的發(fā)展和其遺傳體系的建立［14］。而且，在試管苗增殖過(guò)程中，一旦形成玻璃化苗，其增殖系數(shù)會(huì)明顯下降，不利于繼代和生根培養(yǎng)，降低了組培的效率［15］。在植物組織培養(yǎng)中，蔗糖一直被作為標(biāo)準(zhǔn)碳源，蔗糖的用量是組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵之一。成細(xì)華等［16］在結(jié)球白菜組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高濃度的蔗糖不僅不能克服玻璃化現(xiàn)象，而且抑制了不定芽的分化。因此，適當(dāng)提高蔗糖濃度對(duì)培養(yǎng)壯苗很有必要［17］，何芳蘭等［18］認(rèn)為，增加蔗糖和瓊脂的濃度，可以在不同程度上減少高山杜鵑試管苗玻璃化的發(fā)生，當(dāng)瓊脂濃度0.6%時(shí)，其玻璃化率低，增殖系數(shù)高。研究通過(guò)蔗糖和瓊脂的不同濃度發(fā)現(xiàn)，在和田苜蓿的組織培養(yǎng)中，利用MS培養(yǎng)基，增加適宜濃度的瓊脂，可以降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢(shì)，造成細(xì)胞吸水阻遏，從而降低玻璃化。適當(dāng)提高培養(yǎng)基中蔗糖含量，也可降低培養(yǎng)基中的滲透勢(shì)，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分，降低玻璃化現(xiàn)象。

研究報(bào)道，玻璃化苗發(fā)生百分率和細(xì)胞分裂素成正相關(guān)，其中，6－BA的影響大于ZT和KT［19］。適當(dāng)?shù)募に亟M合可以降低試管苗的玻璃化。實(shí)驗(yàn)研究中，在MS＋2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA 的培養(yǎng)條件下，和田苜蓿玻璃化程度降低，所以，和田苜蓿組織培養(yǎng)可通過(guò)調(diào)整6－BA（2.0mg/L）和 NAA（0.5mg/L）的作用濃度，降低和田苜蓿的玻璃化現(xiàn)象，并且其再生芽增殖較明顯。研究建議今后這些措施可以應(yīng)用于苜蓿組織培養(yǎng)過(guò)程中，消除玻璃化現(xiàn)象，提高苜蓿組織培養(yǎng)的效率。

在植物組織培養(yǎng)中，光照是影響培養(yǎng)效果的主要因子之一［20］。桂明春等［22］通過(guò)對(duì)橡膠樹(shù)不定芽誘導(dǎo)的研究發(fā)現(xiàn)，光照強(qiáng)度能顯著影響不定芽的生長(zhǎng)和形態(tài)，不同光照強(qiáng)度下誘導(dǎo)出的不定芽嫩綠程度不同。研究發(fā)現(xiàn)，在和田苜蓿誘導(dǎo)分化階段，光照強(qiáng)度對(duì)不定芽的再生和植物葉片的形態(tài)具有顯著影響，當(dāng)光照強(qiáng)度為1 000～1 200lx時(shí)，其不定芽嫩綠，玻璃化情況不嚴(yán)重。因此，不同的植物，選擇適宜的光照強(qiáng)度對(duì)組織培養(yǎng)體系的建立具有重要作用。

［1］顧壘，畢玉芬.轉(zhuǎn)基因苜蓿研究的現(xiàn)狀和前景［J］.草原與草坪，2004（1）：17－21.

［2］蘇加楷.中國(guó)牧草新品種選育的回顧與展望［J］.草原與草坪，2001（4）：3－8.

［3］王發(fā)生，李陽(yáng)春，梁慧敏，等.紫花苜蓿愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的研究［J］.草原與草坪，2006（4）：55－58.

［4］卜學(xué)賢，陳維倫.試管植物的玻璃化現(xiàn)象［J］.植物生理學(xué)通訊，1987（5）：13－13.

［5］Debergh P，Aitken－cheristie J，Cohen D，et al.Reconsideration of the term ‘vitrification’as used micropropagation［J］.Plant Cell Tissue Organ Culture，1992，30（2）：135－140.

［6］Debergh P，Harbaoui Y，Lemeur R.Mass propagation of globe artichoke：Evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special reference to water potential［J］.Physiology Plantarum，1981，53（2）：181－187.

［7］陳兵先，黃寶靈，呂成群，等.植物組織培養(yǎng)試管苗玻璃化現(xiàn)象研究進(jìn)展［J］.林業(yè)科技開(kāi)發(fā)，2011，25（1）：1－5

［8］高國(guó)訓(xùn).植物組織培養(yǎng)中的褐變問(wèn)題［J］.植物生理學(xué)通訊，1999，35（6）：501－506.

［9］陶銘.組織培養(yǎng)中畸形胚狀體及超度含水態(tài)苗的研究［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2001，21（5）：1048－1058.

［10］李云霞，馬暉玲，成慧.紫花苜蓿基因轉(zhuǎn)化組織再生過(guò)程中褐化因素的分析［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，2010，32（4）：69－74.

［11］吳麗芳，張鴨關(guān).紫花苜蓿組織培養(yǎng)中常遇問(wèn)題及對(duì)策［J］.草業(yè)與畜牧，2009（9）5－7.

［12］施莉娟，蒲小鵬，溫洋，等.種子消毒方法和激素處理對(duì)和田大葉紫花苜蓿植株再生的影響［J］.草原與草坪，2011，31（1）：54－57.

［13］李紅民，馬暉玲.玻璃化法超低溫保存匍匐翦股穎胚性愈傷組織及其植株再生［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44（4）：62－66.

［14］梁海曼，周菊華.試管苗玻璃現(xiàn)象的生理生化和機(jī)理探討［J］.武漢植物研究，1994（3）：280－288.

［15］蘇燕鈿，胡美蓉，郭曉玲，等.香蕉組培苗玻璃化現(xiàn)象成因之一培養(yǎng)基pH 值［J］.廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2005（3）：5－6.

［16］成細(xì)華，劉凡，曹鳴慶.結(jié)球白菜組培再生苗玻璃化問(wèn)題初步研究［J］.首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001（9）：60－64.

［17］林盛，陳幸華.椰子胚離體培養(yǎng)中的蔗糖效應(yīng)［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，1999，20（1）：20－24.

［18］何芳蘭，李毅，趙明，等.影響高山杜鵑試管苗玻璃化的幾個(gè)因素研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23（1）：104－107.

［19］吳若菁，尤華明，彭東輝.香石竹組培苗玻璃化控制的研究［J］.福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，15（4）：360－363.

［20］沈海龍.樹(shù)木組織培養(yǎng)微體試管外生根育苗技術(shù)［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2009：21－22.

［21］桂明春，梁國(guó)平，段安安.光照強(qiáng)度對(duì)橡膠樹(shù)不定芽誘導(dǎo)的影響［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科技，2011，34（4）：15－18.