劉 磊宋志剛孔 雪 焦洪超 林 海

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018)

隨著養(yǎng)殖業(yè)逐步向規(guī)模化、集約化發(fā)展，養(yǎng)殖過程中存在的諸多應(yīng)激因素亦因之受到重視，如高溫、擁擠、免疫接種、有害氣體等。面對(duì)應(yīng)激，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列生理及神經(jīng)內(nèi)分泌的應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)出食欲、能量存儲(chǔ)以及體內(nèi)能量流動(dòng)模式的變化，動(dòng)物的采食量及采食飼料的種類受到影響，最終造成生產(chǎn)性能及胴體品質(zhì)的改變。研究應(yīng)激對(duì)家禽食欲的影響機(jī)制對(duì)促進(jìn)家禽生產(chǎn)和提高飼料效率意義重大。應(yīng)激反應(yīng)不僅降低了家禽生產(chǎn)性能，也影響到了能量的沉積和利用效率。皮質(zhì)酮處理后的肉仔雞能量利用效率顯著降低［1］，大量能量以脂肪形式被儲(chǔ)存［2］。而高能飼糧能夠緩解應(yīng)激帶來的一些不利影響，如高能飼糧顯著提高了應(yīng)激肉仔雞的采食量和體增重［3］。Zulkifli等［4］發(fā)現(xiàn)應(yīng)激能夠激活家禽的下丘腦－垂體－腎上腺(HPA)軸，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素的大量分泌，糖皮質(zhì)激素與其受體結(jié)合后，能通過改變相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)來調(diào)控機(jī)體能量資源的重新分配。地塞米松(DEX)是一種人工合成的糖皮質(zhì)激素，它能與糖皮質(zhì)激素受體特異性的結(jié)合。相比其他人工合成的糖皮質(zhì)激素而言，DEX作用時(shí)間較長(zhǎng)，更能代表體內(nèi)的糖皮質(zhì)激素的作用模式［5］。Qi等［6］用1 mg/kg的 DEX注射大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠脂肪酸和葡萄糖代謝紊亂。本實(shí)驗(yàn)室在肉仔雞上經(jīng)過長(zhǎng)期試驗(yàn)確定按2 mg/kg DEX對(duì)肉仔雞進(jìn)行長(zhǎng)期(3～7 d)注射，可以成功誘導(dǎo)肉仔雞的糖脂代謝發(fā)生改變［7－9］。

神經(jīng)肽Y(NPY)廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，尤其在下丘腦弓形核(ARC)中高度表達(dá)，其促進(jìn)攝食的功能不斷受到人們的廣泛關(guān)注。NPY神經(jīng)元從ARC投射到腹內(nèi)側(cè)核(VMN)、背內(nèi)側(cè)核(DMN)和室旁核(PVN)，形成了密集的NPY網(wǎng)絡(luò)，此網(wǎng)絡(luò)在攝食調(diào)控中起著重要的作用［10－11］。中樞注射 NPY 可提高鼠、雞、羊和豬的采食量。糖皮質(zhì)激素受體也在家禽的下丘腦中廣泛的分布［12］，而糖皮質(zhì)激素是否會(huì)影響下丘腦中的NPY表達(dá)，尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過腹部注射DEX來模擬應(yīng)激模型，旨在研究肉仔雞在應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)不同能量水平飼糧的偏嗜性，同時(shí)初步研究應(yīng)激影響家禽采食行為的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

體重相近的180只23日齡的雄性愛拔益加(AA)肉雞隨機(jī)分成6組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。試驗(yàn)采用2×3析因設(shè)計(jì)，因素為DEX［處理(注射DEX 2 mg/kg)、未處理(注射等劑量生理鹽水)］和飼糧能量水平［高能(HE)、低能(LE)以及高能、低能自由采食(H-LE)］。H-LE飼糧在1組中同時(shí)放2個(gè)料槽，分別盛有HE飼糧和LE飼糧。預(yù)試期5 d，正試期7 d，為28～34日齡，每天在08:00和10:00之間進(jìn)行注射，期間所有的雞自由飲水。DEX購自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)為H37021969，濃度為3.85 mg/mL。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)據(jù)記錄和樣品采集

每天記錄肉仔雞的體重和采食量，并計(jì)算采食量、體增重、耗料增重比和耗能增重比。34日齡注射后空腹2 h，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3只雞(每個(gè)處理 9只)，翅下靜脈竇采血，肝素抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，－20℃保存待測(cè);然后將肉仔雞屠宰，剝?nèi)∠虑鹉X，于液氮速凍后－80℃冰箱保存以備抽提總RNA;剝離腹脂和腸道(包括十二指腸、空腸和回腸，并去除腸道內(nèi)容物)，稱重并計(jì)算腹脂率和腸道指數(shù)。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air-dry basis) %

1.2.2 血漿指標(biāo)的測(cè)定

血漿中葡萄糖、尿酸和甘油三酯濃度采用VITALAB MICRO半自動(dòng)生化儀測(cè)定，試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所。

1.2.3 下丘腦NPY基因表達(dá)量測(cè)定

下丘腦總RNA用異硫氰二胍鹽法提取，利用瓊脂糖凝膠電泳和生物分光光度計(jì)(Biophotometer plusone，德國(guó)Eppendorf)分別檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。按照TaKaRa RNA PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為:500 ng總RNA、5 mmol/L MgCl2、1 μL RT buffer、1 mmol/L dNTP、2.5 U 逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、0.7 nmol/L oligo d(T)和 10 U Ribonuclease inhibitor，加 DEPC 水至10 μL。42 ℃反應(yīng) 40 min，99 ℃ 滅活 5 min，降低到5℃ 5 min。

cDNA合成以后進(jìn)行熒光定量PCR。磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(上游:5'-ACATGGCATCCAAGGAGTGAG-3'， 下 游:5'-GGGGAGACAGAAGGGAACAGA-3')和NPY的引物(上游:5'-GAGGCACTACTCAACCTCATCAC-3'，下 游:5'-TGTTTTCTGTGCTTTCCCTCAA-3')由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。通過對(duì)混合樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定確定引物的質(zhì)量及最佳的稀釋濃度。反應(yīng)體系為 20 μL:10 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2 × )、上游和下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50 × )、2 μL cDNA模板和6.8 μL去離子水。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95.0℃預(yù)變性10 s;95.0℃變性5 s，60℃延伸和退火34 s，40個(gè)循環(huán)。

參照 Livak 等［13］的方法用 2－ΔΔCt法定量目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為參照基因進(jìn)行校正［7］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，DEX和飼糧能量水平的互作效應(yīng)采用SAS 9.1.3統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA進(jìn)程進(jìn)行雙因子方差分析，以P＜0.05為存在互作效應(yīng)。差異顯著者用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 DEX和飼糧能量水平對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能的影響

由表2可知，DEX處理極顯著降低了肉仔雞的采食量和體增重(P＜0.01)，極顯著提高了耗料增重比和耗能增重比(P＜0.01)。飼糧能量水平對(duì)肉仔雞的體增重(P＜0.05)、耗料增重比(P＜0.05)和耗能增重比(P＜0.01)有顯著影響;其中采用LE飼糧體增重顯著低于其他2種飼糧(P＜0.05)，耗料增重比顯著低于HE飼糧(P＜0.05);采用HE飼糧耗能增重比極顯著高于其他2種飼糧(P＜0.01)，采用LE飼糧極顯著低于其他2組(P＜0.01)。DEX、飼糧能量水平對(duì)耗料增重比(P ＜0.05)和耗能增重比(P ＜0.01)的影響存在顯著的互作效應(yīng)。

2.2 DEX和飼糧能量水平對(duì)肉仔雞血漿生化指標(biāo)的影響

由表3可知，DEX處理極顯著提高了肉仔雞血漿葡萄糖、甘油三酯和尿酸濃度(P＜0.01)，其中葡萄糖濃度提高了68.35%，尿酸濃度提高了208.47%;飼糧能量水平對(duì)血漿葡萄糖、甘油三酯和尿酸濃度影響不顯著(P＞0.05);DEX、飼糧能量水平對(duì)血漿葡萄糖、甘油三酯和尿酸濃度的影響無顯著互作效應(yīng)(P＞0.05)。

2.3 DEX和飼糧能量水平對(duì)肉仔雞腸道指數(shù)、腹脂率和下丘腦NPY基因表達(dá)量的影響

由表4可知，DEX處理顯著提高了肉仔雞的腸道指數(shù)(P＜0.05)，極顯著提高了腹脂率(P＜0.01)。飼糧能量水平對(duì)腹脂率有極顯著影響(P＜0.01)，對(duì)腸道指數(shù)無顯著影響(P＞0.05);采用LE飼糧腹脂率極顯著低于其他2種飼糧(P＜0.01)。DEX、飼糧能量水平對(duì)腸道指數(shù)和腹脂率的影響無顯著互作效應(yīng)(P＞0.05)。

DEX處理對(duì)肉仔雞下丘腦NPY基因表達(dá)量的影響不顯著(P＞0.05)。采用H-LE飼糧NPY基因表達(dá)量顯著高于LE飼糧(P＜0.05)。DEX、飼糧能量水平對(duì)肉仔雞下丘腦NPY基因表達(dá)量的影響無顯著互作效應(yīng)(P＞0.05)。

3 討論

3.1 DEX和飼糧能量水平對(duì)血漿生化指標(biāo)的影響

家禽的肝臟是脂類生成的主要器官［14］，DEX能夠促進(jìn)肝臟內(nèi)的脂類合成［8］，肝臟內(nèi)合成的甘油三酯被運(yùn)輸?shù)窖褐?，血液甘油三酯濃度得到提高。急性?yīng)激時(shí)，HPA軸通過與腎上腺素、胰高血糖素和交感神經(jīng)系統(tǒng)的互作，提高血糖濃度，滿足機(jī)體重要器官對(duì)葡萄糖的需求。在長(zhǎng)期應(yīng)激反應(yīng)中糖皮質(zhì)激素具有重要作用，其作用主要表現(xiàn)為脂肪和肌肉組織的動(dòng)員和肝臟糖異生過程的加強(qiáng)，導(dǎo)致血糖濃度和游離脂肪酸濃度升高［15－16］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在DEX作用下，肉仔雞體內(nèi)的血糖濃度顯著提高，增加了糖原的異生。Lin等［15］研究表明飼糧中添加30 mg/kg的皮質(zhì)酮增強(qiáng)了肉仔雞機(jī)體蛋白質(zhì)的分解代謝;Menconi等［17］在大鼠和小鼠肌小管的體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DEX不僅抑制了蛋白質(zhì)的合成代謝，還促進(jìn)了它的分解代謝，在本試驗(yàn)中，DEX提高了血漿中的尿酸濃度，與前人的研究一致。DEX對(duì)生長(zhǎng)后期的肉仔雞處理7 d，血漿葡萄糖、甘油三酯和尿酸濃度都有相應(yīng)變化，提示DEX已經(jīng)改變了體內(nèi)糖脂代謝過程。

表2 DEX和飼糧能量水平對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of DEX and dietary energy level on performance of broiler chickens

表3 DEX和飼糧能量水平對(duì)肉仔雞血漿生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of DEX and dietary energy level on plasma biochemical indices of broiler chickens

表4 DEX和飼糧能量水平對(duì)肉仔雞腸道指數(shù)、腹脂率和下丘腦NPY基因表達(dá)量的影響Table 4 Effects of DEX and dietary energy level on intestinal tract index，abdominal fat percentage and gene expression level of NPY in the hypothalamus of broiler chickens

續(xù)表4

3.2 DEX和飼糧能量水平對(duì)能量采食的影響

機(jī)體通過控制采食量來調(diào)控機(jī)體的能量平衡，當(dāng)應(yīng)激或運(yùn)動(dòng)發(fā)生時(shí)，機(jī)體的能量消耗增加，采食量也隨之增加，使得耗料增重比降低。用外源導(dǎo)入方式進(jìn)行的研究已證實(shí)皮質(zhì)酮可導(dǎo)致家禽體重和飼料利用率降低［15，18］。Bartov 等［19］研究發(fā)現(xiàn)高濃度的糖皮質(zhì)激素會(huì)引起肉仔雞負(fù)氮平衡，造成骨骼肌萎縮從而影響生長(zhǎng)。Hayashi等［20］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素對(duì)肌肉生長(zhǎng)的抑制作用歸因于骨骼肌蛋白質(zhì)合成率的降低或蛋白質(zhì)降解率的增加，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在本試驗(yàn)中，DEX處理的肉仔雞體重不但不增加反而出現(xiàn)了降低的趨勢(shì)。據(jù)報(bào)道，高水平的糖皮質(zhì)激素可增強(qiáng)小鼠腸系膜區(qū)域的脂肪沉積［21］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DEX處理增強(qiáng)了肉仔雞腹部脂肪沉積，這與前人的研究結(jié)果一致［18，22］。可能的解釋是應(yīng)激抑制了肌肉的發(fā)育并促進(jìn)體內(nèi)的脂肪沉積，從而表現(xiàn)為能量的分配由肌肉組織向脂肪組織轉(zhuǎn)移，造成了能量的浪費(fèi)，使能量利用效率和飼料利用效率顯著降低。Elwinge等［23］已證明雞脂肪沉積量受飼糧的影響。高脂肪飼糧引起的脂蛋白脂酶活性變化，具有組織特異性，能夠提高脂肪組織脂蛋白脂酶的活性，并降低肌肉組織脂蛋白脂酶的活性，從而導(dǎo)致甘油三酯優(yōu)先在脂肪組織沉積［24］。由此提示，HE飼糧可能會(huì)提高肉仔雞脂肪組織脂蛋白脂酶的活性，從而促進(jìn)肉仔雞腹部等處的脂肪沉積，表現(xiàn)出耗能增重比低的現(xiàn)象。皮質(zhì)酮處理后，家禽通過改變攝入食物類型或飼糧偏嗜性來試圖緩解［25］。在哺乳動(dòng)物上的研究顯示，糖皮質(zhì)激素可提高體內(nèi)總能量的攝入量，并呈劑量關(guān)系;皮質(zhì)酮處理使腎上腺切除后的小鼠采食更多的脂肪［26］。在本試驗(yàn)中，DEX、飼糧能量水平對(duì)采食量的影響無顯著互作效應(yīng)，但DEX注射下，動(dòng)物對(duì)高能飼糧的采食量顯著增加，與前人研究結(jié)果一致。

胃腸容積是哺乳動(dòng)物和家禽采食量的一個(gè)限制因素［27］，哺乳動(dòng)物的食道、胃、小腸中均存在著牽張感受器，采食后能激活迷走神經(jīng)，從而興奮下丘腦飽感中樞，使動(dòng)物停止采食。在本試驗(yàn)中，DEX對(duì)腸道指數(shù)的影響可能是因?yàn)镈EX降低了體增重，或是DEX處理造成能量以脂肪形式儲(chǔ)存，使機(jī)體對(duì)能量的需求增加，導(dǎo)致腸道的長(zhǎng)度和重量增加以提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量的攝取。

3.3 DEX和飼糧能量水平對(duì)下丘腦NPY基因表達(dá)量的影響

家禽的采食量是受多方面因素調(diào)控的，如體內(nèi)一些激素(胰島素和瘦素)、食欲因子(NPY、縮膽囊素和饑餓素等)、環(huán)境以及營(yíng)養(yǎng)水平，這些信號(hào)在下丘腦的核團(tuán)中進(jìn)行整合，共同完成對(duì)攝食行為的調(diào)節(jié)［28］。糖皮質(zhì)激素通過其受體參與采食和能量平衡的中樞調(diào)控［16］。有證據(jù)顯示在NPY神經(jīng)元上有糖皮質(zhì)激素的受體，NPY的基因編碼區(qū)上游也攜帶糖皮質(zhì)激素的應(yīng)答片段［29］。體外和體內(nèi)研究結(jié)果表明，糖皮質(zhì)激素能夠激活NPY神經(jīng)元的ARC-PVN路徑，使NPY合成量增加，并對(duì)ARC神經(jīng)元表達(dá) NPY 受體起正調(diào)節(jié)作用［30－31］。糖皮質(zhì)激素還可能直接影響NPY基因表達(dá)，從而增加NPY的合成。Shimizu等［32］通過體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素能增加下丘腦ARC中NPY的表達(dá)。在本試驗(yàn)中，DEX處理提高了肉仔雞下丘腦NPY的表達(dá)量，但并沒有達(dá)到顯著水平，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)重復(fù)數(shù)太少，也可能是腦內(nèi)的多耐藥性糖蛋白作用，Meijer等［33］發(fā)現(xiàn)小鼠腦內(nèi)的多耐藥性糖蛋白能把進(jìn)入腦內(nèi)的DEX不斷清除，這樣對(duì)下丘腦食欲基因產(chǎn)生作用的DEX量減少，不足以引起NPY基因表達(dá)量的顯著變化。但多耐藥性糖蛋白在家禽中還未見有關(guān)報(bào)道，是否是多耐藥性糖蛋白的作用結(jié)果還需進(jìn)一步的研究。

另外，NPY也能感受能量信號(hào)，通過控制機(jī)體采食量，來協(xié)調(diào)動(dòng)物采食量和能量的穩(wěn)態(tài)平衡［32］。已有的研究對(duì)于高脂飼糧影響下丘腦NPY表達(dá)主要集中在哺乳動(dòng)物上，結(jié)果并不一致。Giraudo等［34］研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼糧降低了大鼠 ARC中NPY基因的表達(dá);而Lin等［35］發(fā)現(xiàn)，飼喂1周高脂飼糧對(duì)大鼠下丘腦NPY基因表達(dá)的影響不顯著。但在本試驗(yàn)中，肉仔雞采食H-LE飼糧時(shí)下丘腦NPY基因表達(dá)顯著增加，可能的解釋是NPY對(duì)高脂飼糧的響應(yīng)具有物種特異性，或是由于肉仔雞可根據(jù)自己的需求而自由選擇能量的采食，肉仔雞體內(nèi)的能量穩(wěn)態(tài)處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)過程，NPY感應(yīng)到體內(nèi)的能量狀態(tài)，對(duì)HE或LE飼糧產(chǎn)生了食欲感。

4 結(jié)論

①DEX應(yīng)激可使肉仔雞血漿中葡萄糖、尿酸和甘油三酯的濃度升高。

②DEX應(yīng)激和HE飼糧均能增加脂肪在腹部沉積，提高耗料增重比和耗能增重比。

③H-LE飼糧能上調(diào)肉仔雞下丘腦NPY基因表達(dá)。

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