湯有志，遠(yuǎn)立國，沈祥廣

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣東廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

乙酰甲喹（mequindox）又名痢菌凈，化學(xué)名為3-甲基-2-乙?；?喹喔啉-N1，N4-二氧化物，是20世紀(jì)80年代由我國自主研發(fā)的一類新獸藥，主要用于治療豬痢疾、雞白痢等疾?。?］。因其價格低廉、具有較強的體內(nèi)外抗菌活性，被廣泛用于畜禽疾病的防治，但在使用過程中，雞、豬中毒的事件時有發(fā)生。獸藥等外源性化學(xué)物質(zhì)的代謝物通常是導(dǎo)致動物中毒的主要原因。Liu Z Y 等［2］對喹喔啉N 氧化物類獸藥喹乙醇的代謝物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，認(rèn)為喹乙醇的毒性部分來自其代謝產(chǎn)物。乙酰甲喹具有與喹乙醇相似的喹喔啉母核結(jié)構(gòu)，可能也具有與其相似的毒副作用。因而進(jìn)行乙酰甲喹代謝產(chǎn)物方面的研究對準(zhǔn)確評價其毒副作用、指導(dǎo)其臨床合理用藥、避免藥物殘留、保障食品安全顯得尤為重要。

劉兆穎［3］對乙酰甲喹在肝微粒體中代謝物進(jìn)行了相對定量，認(rèn)為N4-脫一氧乙酰甲喹是乙酰甲喹在豬、雞和大鼠肝微粒體中的主要代謝產(chǎn)物之一。尹伏軍［4］則進(jìn)行了氚標(biāo)乙酰甲喹在大鼠、雞和豬體內(nèi)的吸收分布、排泄和代謝研究，最終確定脫二氧乙酰甲喹（3-甲基-2-乙?；?喹喔啉）為乙酰甲喹在這三種動物體內(nèi)的殘留標(biāo)示物。此外關(guān)于乙酰甲喹及其代謝產(chǎn)物報道多集中在針對其殘留檢測方法［1，5-6］、乙酰甲喹代謝酶的確定［7］及乙酰甲喹代謝產(chǎn)物的毒性等［8-10］方面的研究。而對于乙酰甲喹代謝產(chǎn)物的合成及結(jié)構(gòu)確證工作則少有報道。乙酰甲喹、N4-脫一氧乙酰甲喹和二氧乙酰甲喹的結(jié)構(gòu)式如圖1。本文合成了N4-脫一氧乙酰甲喹和脫二氧乙酰甲喹，運用紅外、核磁及質(zhì)譜技術(shù)手段對上述兩種乙酰甲喹代謝物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征，結(jié)合乙酰甲喹的紅外及核磁數(shù)據(jù)對上述兩種乙酰甲喹代謝物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，以期為乙酰甲喹代謝產(chǎn)物及代謝規(guī)律的深入研究提供依據(jù)。

圖1 乙酰甲喹、N4-脫一氧乙酰甲喹和脫二氧乙酰甲喹結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of mequindox，4-desoxymequindox and 3-methyl-2-acetyl-quinoxaline

1 材料與方法

1.1 材料

Bruker AV-300核磁共振儀，Nicolet 6700傅立葉變換紅外光譜儀（KBr壓片），Aglient 6430質(zhì)譜儀；乙酰甲喹原料藥為廣州惠華動物保健品有限公司產(chǎn)品；薄層層析用GF254硅膠板、柱層析用200～300目硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品；乙醇、保險粉（Na2S2O4）、三氯甲烷、石油醚（60℃～90℃）、乙酸乙酯等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

參照喹烯酮代謝產(chǎn)物的合成方法［11］，并略有改進(jìn)。

1.2.1 N4-脫一氧乙酰甲喹的合成 于100mL三口瓶中加入3g乙酰甲喹，60 mL 乙醇后加熱至乙酰甲喹全溶，加入2.25g Na2S2O4，反應(yīng)40min至乙酰甲喹大部分轉(zhuǎn)化（TLC 監(jiān)測反應(yīng)，展開劑3∶1石油醚／乙酸乙酯），停止反應(yīng)。將反應(yīng)液蒸干，殘渣加入30mL三氯甲烷，超聲5min仍余少量淡黃色不溶物，加入約20 mL 水，不溶物基本全溶。以各20mL三氯甲烷洗深紅色水相3次，合并有機相，以無水Na2SO4干燥后過濾，濾液加1g 100目～200目硅膠后減壓蒸干，以使粗產(chǎn)物均勻吸附在硅膠上。200目～300目硅膠裝柱，以5∶1石油醚／乙酸乙酯為洗脫劑進(jìn)行柱層析，得N4-脫一氧乙酰甲喹1.17 g，產(chǎn)率42.1% ；ESI-MS：m／z 203.2［M＋H］＋。

1.2.2 脫二氧乙酰甲喹的合成 于100mL三口瓶中加入2g乙酰甲喹，40mL乙醇后加熱至乙酰甲喹全溶，加入1.5g Na2S2O4，反應(yīng)40min至乙酰甲喹大部分轉(zhuǎn)化（TLC監(jiān)測反應(yīng)，展開劑3∶1石油醚／乙酸乙酯），加入2g無水碳酸鉀，3h后TLC顯示中間產(chǎn)物完全轉(zhuǎn)化為脫二氧乙酰甲喹，停止反應(yīng)。加入30 mL～40mL水，使反應(yīng)液中固體全溶，加入40mL三氯甲烷，震蕩分層后分出有機相，以各20mL三氯甲烷洗水相3次，合并有機相。無水Na2SO4干燥后過濾，濾液加0.9g 100目～200目硅膠，減壓蒸干有機相，以使粗產(chǎn)物均勻吸附在硅膠上。200目～300目硅膠裝柱，以5∶1石油醚／乙酸乙酯為洗脫劑進(jìn)行柱層析，得脫二氧乙酰甲喹0.9g，產(chǎn)率54.5%；ESI-MS：m／z 187.2［M＋H］＋。

1.2.3 紅外光譜分析 將乙酰甲喹及1.2中所得兩種代謝物分別進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.41H核磁共振譜分析 以氘代氯仿為溶劑，將乙酰甲喹及1.2中所得兩種代謝物分別進(jìn)行核磁共振檢測。

2 結(jié)果

2.1 紅外光譜分析結(jié)果

將乙酰甲喹及1.2中所得兩種代謝物分別進(jìn)行紅外光譜掃描，得3 種化合物紅外譜圖（圖2～圖4）。乙酰甲喹與N4-脫一氧乙酰甲喹在3 400cm-1處有一寬峰，可能為樣品在進(jìn)行溴化鉀壓片時干燥不夠，引入水分產(chǎn)生的吸收峰。乙酰甲喹在1 700.02cm-1，N4-脫 一氧乙酰甲喹在1 706.19 cm-1，脫二氧乙酰甲喹在1 696.80cm-1分別有一峰形尖銳、強度較大的吸收峰，為分子中喹喔啉母核2號位取代羰基的吸收峰［12］。乙酰甲喹在1 330.60、1 341.52cm-1處，有分子中強度最大的吸收峰，為乙酰甲喹中兩個N→O 基團(tuán)的吸收峰；乙酰甲喹經(jīng)Na2S2O4還原后生成N4-脫一氧乙酰甲喹，該化合物在1 327.58cm-1處有尖銳的吸收峰，且該峰強度與分子中羰基的吸收強度相近，表明乙酰甲喹中的一個N→O 基團(tuán)已被還原失去與氮原子配位的氧原子，因而N4-脫一氧乙酰甲喹與乙酰甲喹相比，在該處少一個強度較大的吸收峰。乙酰甲喹還原體系中加入碳酸鉀后，Na2S2O4還原性增強，能將乙酰甲喹上兩個N→O 基團(tuán)徹底還原，所得產(chǎn)物脫二氧乙酰甲喹分子中沒有N→O 基團(tuán)，故而在此處沒有紅外特征吸收。

圖2 乙酰甲喹紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of mequindox

圖3 N4-脫一氧乙酰甲喹紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of 4-desoxymequindox

圖4 脫二氧乙酰甲喹紅外光譜圖Fig.4 IR spectra of 3-methyl-2-acetyl-quinoxaline

2.2 1 H核磁共振譜結(jié)果

以氘代氯仿為溶劑，將乙酰甲喹及1.2中所得2種代謝物分別進(jìn)行核磁共振檢測，得3種化合物核磁共振譜圖（圖5～圖7）。圖5中，0.000為內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷分子中氫對應(yīng)的化學(xué)位移、1.642 為H2O 在氘代氯仿中的化學(xué)位移、7.270為氘代氯仿中少量氯仿中氫的化學(xué)位移。芳環(huán)上甲基取代對其鄰、間、對位氫的化學(xué)位移（δ）影響不大，乙?；〈鷦t會使苯環(huán)上剩余氫的δ 值變大而鄰位變化最大［12］。此外，1，4位N→O 的強吸電子作用，會使喹喔啉母核電子云密度降低，導(dǎo)致5～8號氫尤其是與N→O 相鄰，5，8號氫的δ變大。因而在乙酰甲喹分子中，8 號氫的位移最大，對應(yīng)圖5 中δ8.658～8.623；5號氫位移次之，對應(yīng)圖5 中δ8.586～8.553；6，7號氫對應(yīng)δ7.914～7.861處的多重峰。1，4位N→O 對2，3號位的電子效應(yīng)相同，而乙酰基中羰基的吸電子作用，會使與其鄰位甲基的δ值大于3號位甲基。乙?；屑谆鶎?yīng)δ＝2.745處單峰，乙酰甲喹分子中3號位甲基則對應(yīng)δ＝2.550處單峰。以2.550處單峰積分為3.00，所得各氫原子個數(shù)與分子中氫原子分布相同。

由紅外數(shù)據(jù)可知脫二氧乙酰甲喹分子中不含N→O 基團(tuán)，比較圖5與圖7的1H核磁共振譜圖，可知N→O 的存在使喹喔啉環(huán)上氫原子δ值變小，而使環(huán)上的3號位甲基及2號位乙?；屑谆摩闹底兇?。圖6與圖5相比，分子中6、7、8號氫δ值變化較?。ǎ?0.03），而5 號氫δ值變化較大（～-0.4）?；诩t外譜圖已顯示分子中保留有一個N→O 基團(tuán)，我們認(rèn)為該基團(tuán)應(yīng)位于喹喔啉母環(huán)的1號位，即4號位N→O 基團(tuán)已被Na2S2O4還原。而喹喔啉母環(huán)上N→O 基團(tuán)的減少，也使分子中兩個甲基對應(yīng)的δ值均有增加，而4號位N→O 基團(tuán)被還原對3號位甲基的影響更大，因而會導(dǎo)致代謝產(chǎn)物中兩個甲基間δ值差值的下降。這一點也在圖6中得到體現(xiàn)（Δδ由0.195降至0.009）。由此可確定本文所得脫一氧乙酰甲喹為N4-脫一氧乙酰甲喹。

圖6 N4-脫一氧乙酰甲喹1H核磁共振譜圖Fig.6 1H-NMR spectra of 4-desoxymequindox

圖7 脫二氧乙酰甲喹1H核磁共振譜圖Fig.7 1H-NMR spectra of 3-methyl-2-acetyl-quinoxaline

3 討論

藥物代謝是藥物在動物體內(nèi)產(chǎn)生藥效及毒性的重要過程，因而，藥物代謝的研究對于指導(dǎo)用藥具有極其重要的理論意義。乙酰甲喹作為我國自主研發(fā)的一類新獸藥，主要用于食品動物疾病的防治，其代謝產(chǎn)物及代謝機制的研究對于避免其在食品動物中的殘留具有重要意義。盡管本文合成得到了2種乙酰甲喹代謝物，但反應(yīng)產(chǎn)率尚需提高。此外，尚需對乙酰甲喹可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行逐一合成及光譜表征，最終確證其代謝產(chǎn)物，進(jìn)而進(jìn)行乙酰甲喹代謝方面的深入研究，為指導(dǎo)乙酰甲喹在食品動物上的使用及解決由此產(chǎn)生的食品安全問題提供理論依據(jù)。

［1］Liu Y，Si H，He L，et al.Identification of mequindox and its metabolites by high performance liquid chromatography combined with ion trap-time of flight-mass spectrometry［J］.Fenxi Huaxue，2010，38（1）：82-86.

［2］Liu Z Y，Huang L L，Dai M H，et al.Metabolism of olaquindox in rat liver microsomes：structural elucidation of metabolites by high-performance liquid chromatography combined with ion trap／time-of-flight mass spectrometry［J］.Rapid Communications In Mass Spectrometry，2008，22（7）：1009-1016.

［3］劉兆穎.喹噁啉類在大鼠、豬和雞的比較代謝研究［D］.湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［4］尹伏軍.氚標(biāo)乙酰甲喹的合成及其在動物體內(nèi)的處置研究［D］.湖北武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［5］Liu Y，Ding H，Liu Y，et al.Determination of main metabolites of mequindox excretion in chicken feces.［J］.Xumu Shouyi Xuebao，2011，42（1）：104-109.

［6］Duan Z，F(xiàn)ang G，Pan M，et al.Simultaneous determination of five quinoxaline-1，4-dioxides and two major metabolites in surface water by on-line solid phase extraction coupled to highperformance liquid chromatography［J］.Anal Methods，2011，3（8）：1821-1827.

［7］Liu J，Ge X，Ouyang M，et al.Catalytic characteristics of CYP3A22-dependent Mequindox detoxification［J］.Catal，2011，12（7）：637-643.

［8］Huang X，Wang X，Ihsan A，et al.Interactions of NADPH oxidase，renin-angiotensin-aldosterone system and reactive oxygen species in mequindox-mediated aldosterone secretion in Wistar rats［J］.Toxicology，2010，198（2）：112-118.

［9］Wang X，Huang X，Ihsan A，et al.Metabolites and JAK／STAT pathway were involved in the liver and spleen damage in male Wistar rats fed with mequindox［J］.Toxicology，2011，280（3）：126-134.

［10］Ihsan A，Wang X，Liu Z，et al.Long-term mequindox treatment induced endocrine and reproductive toxicity via oxidative stress in male Wistar rats.［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2011，252（3）：281-288.

［11］Li J，Zhang J，Zhou X，et al.Synthesis of the possible metabolites of quinocetone in animals.［J］.Heterocycl Commun，2007，13（1）：49-56.

［12］寧永成.有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定與有機波譜學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2000.